Κώστας Βαγενάς: Ο επιστήμονας που άφησε το ΜΙΤ για την Πάτρα ανατρέπει τους κανόνες της Φυσικής

Newsroom , CNN Greece

Κυριακή, 02 Φεβρουαρίου 2020

    

Πηγή: ΑΠΕ-ΜΠΕ

Ένας διακεκριμένος Έλληνας επιστήμονας, ο χημικός μηχανικός και φυσικοχημικός  Κώστας Βαγενάς, μέλος της Ακαδημίας Αθηνών και της Εθνικής Ακαδημίας Μηχανικών των ΗΠΑ, ομότιμος καθηγητής του Τμήματος Χημικών Μηχανικών του Πανεπιστημίου Πατρών, επίτιμος καθηγητής του Αριστοτέλειου Πανεπιστημίου  Θεσσαλονίκης  και πρώην καθηγητής των πανεπιστημίων ΜΙΤ και Yale, έχει αναπτύξει ένα ανατρεπτικό μηχανικό  πρότυπο  (μοντέλο), το οποίο, αν επαληθευτεί πλήρως, τότε θα πρέπει να ξαναγραφτούν πολλά βιβλία της Φυσικής  παγκοσμίως.

Η επίλυση του μοντέλου που, όπως αναφέρεται στην τελευταία επιστημονική δημοσίευση του, είναι σε εξαιρετική συμφωνία με τα βιβλιογραφικά πειραματικά δεδομένα, δείχνει ότι οι θεμέλιοι λίθοι και η δομή της ύλης δεν είναι αυτοί που εδώ και δεκαετίες παρουσιάζει το λεγόμενο «Καθιερωμένο Πρότυπο» (Standard Model).

Το νέο μοντέλο οδηγεί στο συμπέρασμα ότι οι μέχρι τώρα θεωρούμενες τέσσερις δυνάμεις της Φύσης είναι μόνο δύο, η Βαρύτητα και ο Ηλεκτρομαγνητισμός, καθώς η Ισχυρή και η Ασθενής Δύναμη ανάμεσα στα σωματίδια εξηγούνται από τη Βαρύτητα και την Σχετικότητα του Αϊνστάιν, ο συνδυασμός των οποίων δημιουργεί την μάζα των συνθέτων σωματιδίων. Το πρότυπο αυτό λέγεται «Μοντέλο των Περιστρεφομένων Λεπτονίων»  (Rotating Lepton Model ή RLM) και χρησιμοποιεί την μεθοδολογία του γνωστού μοντέλου Bohr για το υδρογόνο, με την Βαρύτητα ως κεντρομόλο δύναμη.

Ο κ. Βαγενάς και οι συνεργάτες του Δ. Τσούσης και Δ. Γρηγορίου του Πανεπιστημίου Πατρών, σε δημοσίευση τους στο περιοδικό «Physica A», χρησιμοποιούν το νέο μοντέλο για τον υπολογισμό των μαζών 15 συνθέτων σωματιδίων (πρωτονίων, νετρονίων, άλλων αδρονίων αλλά και μποζονίων) και επιτυγχάνουν εκπληκτική συμφωνία (με ακρίβεια 1%) με τις πειραματικές τιμές, χωρίς καμία άγνωστη παράμετρο. Επίσης δείχνουν ότι η ύλη αποτελείται από πέντε θεμελιώδη (Δημοκρίτεια, δηλαδή άτμητα) σωματίδια: τρία νετρίνα, το ηλεκτρόνιο και το ποζιτρόνιο (σωματίδιο αντιύλης με αντίθετο ηλεκτρικό φορτίο από το ηλεκτρόνιο). Τα κουάρκς, που αναγνωρίζει το «Καθιερωμένο Πρότυπο» ως θεμελιώδη σωματίδια, είναι στην πραγματικότητα, σύμφωνα με το νέο μοντέλο, ταχύτατα νετρίνα που κινούνται σε κυκλικές τροχιές με ταχύτητα πολύ κοντά στην ταχύτητα του φωτός.

Οι μεγάλες ταχύτητες των νετρίνων δημιουργούν, σύμφωνα με τον Αϊνστάιν, μεγάλη αδρανειακή και βαρυτική μάζα, ούτως ώστε δημιουργείται η μάζα των αδρονίων, όπως είναι τα πρωτόνια και τα νετρόνια. Από το νέο μοντέλο RLM συνεπάγεται ότι η Ισχυρή Δύναμη είναι απλώς η βαρυτική έλξη μεταξύ των σωματιδίων αυτών, που κινούνται περίπου με την ταχύτητα του φωτός. Δηλαδή η Ισχυρή Δύναμη είναι Σχετικιστική Βαρύτητα μεταξύ νετρίνων, ενώ η Ασθενής Δύναμη είναι Σχετικιστική Βαρύτητα μεταξύ νετρίνων και ηλεκτρονίων ή ποζιτρονίων.

Το Αθηναϊκό και Μακεδονικό Πρακτορείο Ειδήσεων ζήτησε από τον κ. Βαγενά να μιλήσει για το μοντέλο του και τα νέα αποτελέσματα:

Ποιες είναι οι κυριότερες θεωρίες της σωματιδιακής Φυσικής που η δική σας θεωρία έρχεται να καταρρίψει;

Η δική μας θεώρηση διαφέρει ουσιωδώς από το καθιερωμένο πρότυπο στο ότι, βασιζόμενοι μόνο σε θεμελιώδεις νόμους της Φυσικής, αποδεικνύουμε ότι η δύναμη που συγκρατεί τα συστατικά των πυρήνων, είναι βαρυτικής φύσεως. Δηλαδή περιγράφεται από ένα απλό συνδυασμό του βαρυτικού Νόμου του Νεύτωνα και της βασικής εξίσωσης της Ειδικής Σχετικότητας του Αϊνστάιν, χωρίς να χρειάζεται επίκληση της Ισχυρής Δύναμης.

Μια άλλη διαφορά είναι ότι στο προτεινόμενο μοντέλο δεν χρειάζεται να θυσιάσουμε την αιτιοκρατία των φυσικών νόμων της κίνησης, αλλά απλώς να τη συνδυάσουμε με τoν κυματοσωματιδιακό δυισμό της ύλης, όπως έκανε ο Μπορ με το παγκοσμίως γνωστό μοντέλο του υδρογόνου.

Το «Μοντέλο των Περιστρεφομένων Λεπτονίων» (RLM) χρησιμοποιεί την μεθοδολογία του μοντέλου Bohr για το υδρογόνο. Άρα δεν δημιουργήσαμε κάποια νέα θεωρία, απλώς συνδυάσαμε ως μηχανικοί και φυσικοχημικοί τους γνωστούς νόμους της βαρύτητας του Νεύτωνα, της ειδικής σχετικότητας του Αϊνστάιν και την εξίσωση του De Broglie, που υπήρξε η βάση της κβαντομηχανικής.

Τα σύνθετα σωματίδια που αρχικά θέλουμε να περιγράψουμε, είναι το νετρόνιο και το πρωτόνιο, που εμπεριέχει και ένα ποζιτρόνιο. Η εικόνα που δημιουργούμε, είναι ότι καθένα αποτελείται από μία τριάδα περιστρεφομένων σωματιδίων, τα οποία διατηρούνται στην κυκλική τροχιά τους από την αμοιβαία βαρυτική τους έλξη.

Τα σωματίδια αυτά αποδεικνύουμε ότι είναι απλώς ταχέως περιστρεφόμενα νετρίνα με ταχύτητα πολύ κοντά στην ταχύτητα του φωτός, έτσι που, σύμφωνα με την ειδική Σχετικότητα του Αϊνστάιν, η μάζα τους αυξάνεται πολύ και φθάνει το ένα τρίτο της μάζας του πρωτονίου ή νετρονίου. Άρα τα κουάρκς του καθιερωμένου προτύπου είναι απλώς ταχέα -σχετικιστικά- νετρίνα.

Τέλος, το RLM αποδεικνύει ότι από τα 16 «θεμελιακά» σωματίδια του καθιερωμένου προτύπου, μόνο τα πέντε -ποζιτρόνια, ηλεκτρόνια και τα τρία νετρίνα- είναι θεμελιώδη με την Δημοκρίτεια έννοια σωματίδια, ενώ τα υπόλοιπα αποτελούν συνδυασμούς αυτών των πέντε ή δεν υπάρχουν, όπως π.χ. το γκλουόνιο.

Ποια είναι η έως τώρα αντίδραση των Ελλήνων και ξένων συναδέλφων σας επιστημόνων, ιδίως των φυσικών, απέναντι στις αντισυμβατικές απόψεις σας που «ξαναγράφουν» τα βιβλία της Φυσικής;

Πρέπει να τονισθεί ότι κανείς φυσικός μέχρι τώρα δεν έχει υποδείξει οποιοδήποτε σφάλμα στην συλλογιστική και στα μαθηματικά του RLM. Το καθιερωμένο πρότυπο έχει καταφέρει ορισμένες σημαντικές επιτυχίες στην περιγραφή των σωματιδιακών αλληλεπιδράσεων σε μια ευρεία περιοχή φαινομένων, όμως περιέχει 26 προσαρμοζόμενες σταθερές, δηλαδή 26 αυθαίρετες ρυθμίσεις, ενώ το RLM δεν περιέχει καμία.

Παρουσιάσαμε το μοντέλο μας κατόπιν προσκλήσεως δύο φορές, το 2017 και το 2019, στο παγκόσμιο συνέδριο Σωματιδιακής Φυσικής «Lomonosov Conference on Particle Physics» στη Μόσχα μπροστά σε περίπου 400 φυσικούς, κάθε φορά με μεγάλη επιτυχία. Λάβαμε μόνο εποικοδομητικές και εξαιρετικά ενδιαφέρουσες απορίες και σχόλια, περιλαμβανομένων των ιδιαίτερα κολακευτικών σχολίων του προέδρου του Συνεδρίου καθηγητή Αλεξάντερ Στουντενίκιν. 

Προ μηνών κάνατε μια επιστημονική περιοδεία σε κορυφαία αμερικανικά πανεπιστήμια παρουσιάζοντας τη θεωρία σας. Ποιες ήταν οι αντιδράσεις;

Οι ομιλίες που έδωσα σε επτά κορυφαία αμερικανικά πανεπιστήμια (MIT, Πρίνστον, Μπέρκλεϊ, Στάνφορντ, Caltech, Πανεπιστήμιο Νότιας Καλιφόρνιας και Καλιφόρνιας-Σαν Ντιέγκο), από 14 έως 30 Σεπτεμβρίου 2019, στέφθηκαν από μεγάλη επιτυχία, θετικότατες αντιδράσεις και εξαιρετικές ερωτήσεις. Βεβαίως οι περισσότεροι ακροατές ήταν Φυσικοχημικοί και Χημικοί Μηχανικοί, όμως υπήρχαν και αρκετοί Φυσικοί που έθεσαν πολύ καλές και εποικοδομητικές ερωτήσεις.

Πόσες ελπίδες έχει ένας Έλληνας επιστήμονας και μάλιστα χημικός να φέρει τα πάνω-κάτω στη Φυσική; Υπάρχουν συγκεκριμένα πειράματα που θα μπορούσαν να επιβεβαιώσουν τη θεωρία σας;

Όταν η νέα θεώρηση είναι απλούστερη και υποστηρίζεται από το πείραμα, όπως στην προκειμένη περίπτωση από τις με ακρίβεια 1% υπολογιζόμενες μάζες 15 εκ των κυριότερων συνθέτων σωματιδίων χωρίς καμία προσαρμοζόμενη παράμετρο, τότε οι ελπίδες είναι σημαντικές, παρά τις δυσκολίες και την διαφορετική γλώσσα που χρησιμοποιούν οι δύο κοινότητες.

Όπως είναι αναμενόμενο, υπάρχει μεγάλη ποικιλομορφία στο τρόπο με τον οποίο η επιστημονική κοινότητα αντιμετωπίζει τη νέα θεώρηση. Όμως παρά τις δυσκολίες, έχουμε ήδη κάνει περί τις 20 δημοσιεύσεις σε καλά περιοδικά με κριτές, καθώς και σε ένα βιβλίο της Springer.

Ας μην ξεχνάμε ότι οι Φυσικοχημικοί έχουν ήδη παίξει στο παρελθόν σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση της σύγχρονης Φυσικής. Η εργασία μας δείχνει ότι υπάρχουν σημαντικοί δίαυλοι μεταφοράς χρήσιμης τεχνογνωσίας ανάμεσα στην Θεωρητική Φυσική και στην Φυσικοχημεία.

Πέραν της εντυπωσιακής συμφωνίας ανάμεσα στο πείραμα και στις -χωρίς άγνωστες σταθερές- προβλέψεις του μοντέλου για τις μάζες των 15 πλέον σημαντικών συνθέτων σωματιδίων, κάτι που το καθιερωμένο πρότυπο αδυνατεί εντελώς να κάνει χωρίς προσαρμοζόμενες παραμέτρους, υπάρχουν και άλλα, δύσκολα όμως, πειράματα που θα μπορούσαν να επιβεβαιώσουν το RLM, όπως η πραγματοποίηση των πειραμάτων εξαΰλωσης ζευγών ποζιτρονίων - ηλεκτρονίων στα εργαστήρια Superkamiokade και IceCube, που ευρίσκονται σε μεγάλο βάθος κάτω από την επιφάνεια της Γης, με συνέπεια την ύπαρξη μειωμένης συγκέντρωσης νετρίνων. Το RLM προβλέπει ότι ο σχηματισμός αδρονίων (αδρονοποίησης) από τα νετρίνα θα είναι σημαντικά μικρότερος σε αυτή την περίπτωση.

Έχοντας μεγάλη πανεπιστημιακή/ακαδημαϊκή/ερευνητική πείρα εντός και εκτός Ελλάδος, πώς κρίνετε τις έως τώρα πρωτοβουλίες της κυβέρνησης στο χώρο των ΑΕΙ; Θα είχατε κάποια συμβουλή για την υπουργό κ. Κεραμέως;

Οι πρωτοβουλίες της κ. Κεραμέως στον χώρο των ΑΕΙ έχουν γενικά αγαθές προθέσεις, που όμως θα κριθούν τελικά στην πράξη. Βασικό ζητούμενο είναι η βελτίωση της ποιότητας της διδασκαλίας και της έρευνας και η δημιουργία κλίματος συναίνεσης, σεβασμού των δικαιωμάτων όλων και η, σύμφωνα με τα διεθνή πρότυπα, απρόσκοπτη λειτουργία των Πανεπιστημίων μας.

Διδάσκω στο ελληνικό Πανεπιστήμιο επί 40 έτη, εκ των οποίων υπολογίζω ότι τα πέντε περίπου τα έχω περάσει, όπως και οι περισσότεροι συνάδελφοι και συνεργάτες μου, κλειδωμένοι έξω από τα γραφεία και εργαστήριά μας, ως αποτέλεσμα άχρηστων καταλήψεων, που από μόνες τους αποτελούν σε καιρό Δημοκρατίας παραβίαση του Πανεπιστημιακού ασύλου. Πρέπει να καλλιεργηθεί στο Πανεπιστήμιό μας ένα κλίμα σεβασμού των δημοκρατικών δικαιωμάτων όλων, φοιτητών και εργαζομένων.

Θα συμβούλευα την κ. Κεραμέως να περιορίσει, όσο είναι δυνατό, τις αρνητικές συνέπειες της πρόσφατης από τον κ. Γαβρόγλου ανωτατοποίησης των ΤΕΙ και της συνένωσης τους με τα Πανεπιστήμια, που είναι εντελώς αρνητικές για τα Πανεπιστήμια, για τα ΤΕΙ και για την χώρα. Επίσης θα την παρότρυνα να αγωνισθεί για την αύξηση των αποδοχών των διδασκόντων στα Πανεπιστήμια μας, για να περιορισθεί και να αντιστραφεί το brain drain και να ανέβει έτσι και η ποιότητα των Πανεπιστημίων μας, που έχει υποχωρήσει σημαντικά σε όλους τους δείκτες τα τελευταία 15 χρόνια.

Κάποτε φύγατε από το ΜΙΤ για να γυρίσετε στην Ελλάδα. Σήμερα θα συμβουλεύατε τους Έλληνες επιστήμονες στο εξωτερικό να κάνουν το ίδιο ή η διεθνής εμπειρία είναι προτιμότερη;

Η διεθνής εμπειρία είναι εντελώς αναγκαία, αν θέλουμε να είμαστε διεθνώς ανταγωνιστικοί. Στο Ισραήλ ήταν, και πιστεύω είναι, αναγκαστική προϋπόθεση για ένταξη σε βαθμίδα καθηγητική η διετής εμπειρία μετά το διδακτορικό σε υψηλής ποιότητας αμερικανικά ή ευρωπαϊκά πανεπιστήμια.

Ναι, θα συμβούλευα τους Έλληνες επιστήμονες του εξωτερικού να γυρίσουν, κατά προτίμηση όμως σε Τμήματα όπου κάποιοι από τους διδάσκοντες έχουν εργασθεί σε ξένα πανεπιστήμια και ερευνητικά κέντρα.

Προσωπικά, δεν μετανιώνω που άφησα το ΜΙΤ και γύρισα στην Πάτρα το 1981. Ήμουν τυχερός που βρήκα καλούς συναδέλφους, συνεργάτες και φοιτητές και έτσι μπόρεσα και εκμεταλλεύτηκα αυτό που προσφέρει απλόχερα η πατρίδα μας: Πολύ χρόνο για σκέψη, διδασκαλία, έρευνα και δημιουργία.

ΠΗΓΗ: CNN Greece

---

Michele Bellesi , Luisa de Vivo , Mattia Chini , Francesca Gilli , Giulio Tononi και Chiara Cirelli

Journal of Neuroscience 24 Μαΐου 2017, 37 (21) 5263-5273; DOI: https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.3981-16.2017

---

Η απώλεια ύπνου προωθεί την αστροκυτταρική φαγοκυττάρωση και την μικρογλοιακή ενεργοποίηση στον εγκεφαλικό φλοιό ποντικού

Έρευνα σε Ποντίκια

---

Μετάβαση σε ενότητα

 

1.                  Αρθρο

o         Περιληπτική έκθεση

o         Εισαγωγή

o         Υλικά και μέθοδοι

o         Αποτελέσματα

o         Συζήτηση

o         Υποσημειώσεις

o         Βιβλιογραφικές αναφορές

2.                  Αριθμοί & Δεδομένα

3.                  Πληροφορίες & μετρήσεις

4.                  Ε-Γράμματα

5.                  PDF

---

 

Περιληπτική έκθεση

 

Στο παρελθόν βρήκαμε ότι ο Mertk και ο σύνδεσμος Gas6, τα αστροκυτταρικά γονίδια που εμπλέκονται στη φαγοκυττάρωση, ρυθμίζονται προς τα πάνω μετά από στέρηση στενού ύπνου. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα αστροκύτταρα μπορεί να εμπλέκονται σε φαγοκυτταρική δραστηριότητα κατά τη διάρκεια της εκτεταμένης αφύπνισης, αλλά δεν υπάρχουν άμεσα στοιχεία. Μελέτες σε ανθρώπους και τρωκτικά έδειξαν επίσης ότι η απώλεια ύπνου αυξάνει τους περιφερειακούς δείκτες της φλεγμονής, αλλά αν αυτές οι αλλαγές σχετίζονται με νευροφλεγμονή ή / και ενεργοποίηση μικρογλοίας, τα έμφυτα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος του εγκεφάλου, ήταν άγνωστη. Εδώ χρησιμοποιήσαμε μικροσκόπιο ηλεκτρονικής σάρωσης ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης για να λάβουμε 3D μετρήσεις όγκου των συνάψεων και των περιβαλλόντων αστροκυτταρικών διεργασιών στον μετωπιαίο φλοιό του ποντικιού μετά από 6-8 ώρες ύπνου, αυθόρμητη αφύπνιση ή στέρηση ύπνου (SD) και μετά από χρόνια (~ 5 ημέρες) περιορισμός ύπνου (CSR). Η αστροκυτταρική φαγοκυττάρωση, κυρίως των προσυναπτικών συστατικών των μεγάλων συνάψεων, αυξήθηκε μετά από οξεία και χρόνια απώλεια ύπνου σε σχέση με τον ύπνο και την αφύπνιση. Η έκφραση του MERTK και η υπεροξείδωση των λιπιδίων σε συναπτεροευρωσώματα αυξήθηκαν επίσης σε παρόμοια έκταση μετά από σύντομη και μακρά απώλεια ύπνου, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αστροκυτταρική φαγοκυττάρωση μπορεί να αντιπροσωπεύει την ανταπόκριση του εγκεφάλου στην αύξηση της συναπτικής δραστηριότητας που σχετίζεται με την παρατεταμένη αφύπνιση και την απομάκρυνση των φθαρμένων συστατικών των βαριά χρησιμοποιούμενων συνάψεων. Χρησιμοποιώντας ομοπολική μικροσκοπία, διαπιστώσαμε τότε ότι τα CSR αλλά όχι τα SD ποντίκια παρουσιάζουν μορφολογικά σημάδια μικρογλωσσικής ενεργοποίησης και αυξημένη μικρογλοιακή φαγοκυττάρωση συναπτικών στοιχείων, χωρίς εμφανή σημάδια νευροφλεγμονής στο ΚΠΧ. Επειδή η ενεργοποίηση μικρογλυκαιμίας χαμηλού επιπέδου μπορεί να οδηγήσει σε μη φυσιολογικές αποκρίσεις σε δευτερογενή προσβολή, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η χρόνια απώλεια ύπνου, μέσω της εκκίνησης μικρογλοίας, μπορεί να προδιαθέσει τον εγκέφαλο να βλάψει περαιτέρω.

ΔΗΛΩΣΗ ΣΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗΣ 

Θεωρούμε ότι η αστροκυτταρική φαγοκυττάρωση των συναπτικών στοιχείων, κυρίως της προευναπτικής προέλευσης και στις μεγάλες συνάψεις, ρυθμίζεται προς τα πάνω ήδη μετά από λίγες ώρες στέρησης του ύπνου και παρουσιάζει μια περαιτέρω σημαντική αύξηση μετά από παρατεταμένη και σοβαρή απώλεια ύπνου, υποδηλώνοντας ότι μπορεί να προωθήσει τη νοικοκυριό των ισχυρά χρησιμοποιούμενων και ισχυρών συνάψεων ως απόκριση στην αυξημένη νευρωνική δραστηριότητα του εκτεταμένου αφύπνισης. Αντιθέτως, ο χρόνιος περιορισμός του ύπνου αλλά όχι η οξεία απώλεια ύπνου ενεργοποιεί το μικρογλοία, προάγει τη φαγοκυτταρική δραστικότητα αυτών και το κάνει απουσία εμφανών σημείων νευροφλεγμονής, υποδηλώνοντας ότι, όπως και πολλοί άλλοι παράγοντες άγχους, η εκτεταμένη διακοπή του ύπνου μπορεί να οδηγήσει σε κατάσταση σταθερής ενεργοποίησης μικρογλοίας , ίσως αυξάνοντας την ευαισθησία του εγκεφάλου σε άλλες μορφές βλάβης.

       Αστροκύτταρο  |  Φλοιός  |  Μικρογλοία  |  Ποντίκια  | Ύπνος  |  Στέρηση ύπνου

Εισαγωγή

 

Τα αστροκύτταρα επηρεάζονται από αλλαγές στην κατάσταση συμπεριφοράς. Χρησιμοποιώντας την ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης με δέσμη προσώπου (SBEM), πρόσφατα διαπιστώσαμε ότι οι περισσότερες συναισθηματικές συνάψεις σε μετωπικό φλοιό ποντικού έρχονται σε επαφή με περιφερειακές αστροκυτταρικές διεργασίες (PAPs). Τα PAP κινούνται πιο κοντά στη συναπτική σχισμή και επεκτείνονται μετά από εκτεταμένο συναγερμό, πιθανώς επειδή αυξάνεται η ανάγκη καθαρισμού των ιόντων γλουταμινικού και καλίου. Το μεταγραφικό προφίλ έδειξε επίσης ότι η έκφραση του ~ 1,4% των αστροκυτταρικών γονιδίων εξαρτάται από την κατάσταση και ως επί το πλείστον ρυθμίζεται προς τα πάνω ως προς τον ύπνο ( Bellesi et al., 2015 ). Τα αστροκυτταρικά γονίδια "ξυπνούν" σε ποντικούς συμπεριλάμβαναν Mertk ( Bellesi et αϊ., 2015 ) και προηγούμενα πειράματα σε αρουραίους διαπίστωσαν ότι το Gas6( Cirelli et al., 2006 ). Ο υποδοχέας MERTK ανήκει σε μία από τις δύο οδούς που μεσολαβούν στην αστροκυτταρική φαγοκυττάρωση (AP, Chung κ.ά., 2015 ) και μέσω της δράσης της GAS6 (πρωτεΐνη 6 ειδικής σύλληψης ανάπτυξης) συνδέεται με εκτεθειμένη φωσφατιδυλοσερίνη σε υπολείμματα στόχου ( Grommes et αϊ. 2008 ). Το AP συμμετέχει σε αναπτυξιακό συναπτικό κλάδεμα ( Berbel and Innocenti, 1988 , Chung et al., 2013 ) και τα αστροκύτταρα ενηλίκων αγγίζουν τα αξονικά οργανίδια και τα συναπτικά στοιχεία ακόμη και σε υγιή ποντίκια, υποδηλώνοντας ότι η συστατική τους φαγοκυτταρική δραστηριότητα συμβάλλει στην εκκαθάριση των κατεστραμένων κυτταρικών συστατικών ( Nguyen et al., 2011;Chung κ.ά., 2013 . Davis et al., 2014 ), πιθανότατα σε απόκριση της σχετιζόμενης με αφύσωση νευρωνικής δραστηριότητας ( Chung et αϊ., 2015 ).

Τα Microglia είναι τα κατονομαζόμενα φαγοκύτταρα του ΚΝΣ. Παρακολουθούν συνεχώς το περιβάλλον του μικροπεριβάλλοντος μέσω των διαδικασιών τους, την νευρωνική δραστηριότητα, τα καθαρά νευρωνικά συντρίμμια μετά τον τραυματισμό και τον κυτταρικό θάνατο ( Wake et al., 2009 , Tremblay et al., 2010 , Tay κ.ά., 2017 ). ( Paolicelli et al., 2011 · Schafer et al., 2012 · Bialas and Stevens, 2013 · Sipe et al., 2016 ). Η φαγοκυττάρωση μικρογλοίας διαμεσολαβείται από τα C1q και C3, συστατικά του καταρράκτη συμπληρώματος που σημαίνουν ανεπιθύμητες συνάψεις. από τον υποδοχέα φαγοκυτταρικού συμπληρώματος που εκφράζεται από μικρογλοία ( Stevens et al., 2007) · και από το MERTK, το οποίο επίσης εκφράζεται σε μικρογλοία ( Chung et al., 2013 ). Οποιαδήποτε διαταραχή της ομοιόστασης του εγκεφάλου, συμπεριλαμβανομένης της φλεγμονής, ενεργοποιεί την μικρογλοία. Η οξεία και η χρόνια στέρηση του ύπνου μπορεί να οδηγήσει σε μια προ-φλεγμονώδη κατάσταση απουσία εμφανής μόλυνσης ή τραυματισμού ( Mullington et al., 2010, Hurtado-Alvarado et al., 2013 ). Συγκεκριμένα, σε ανθρώπους και τρωκτικά, η απώλεια ύπνου μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένο αριθμό λευκών αιμοσφαιρίων. αυξημένα επίπεδα κυκλοφορίας της C-αντιδρώσας πρωτεΐνης, IL1β, IL6 και TNFa ( Everson, 2005 , Mullington et al., 2010 , Hurtado-Alvarado κ.ά., 2013 , He κ.ά., 2014 ). και ενισχυμένη διαπερατότητα του αιματοεγκεφαλικού φραγμού (Hurtado-Alvarado et αϊ., 2013 ; He et al., 2014 ). Η πηγή της αύξησης των περιφερικών κυτοκινών παραμένει ασαφής αλλά έχει συνδεθεί με την αύξηση των επιπέδων κατεχολαμίνης που σχετίζονται με την παρατεταμένη αφύπνιση ( Mullington et al., 2010 ). Εξίσου ασαφές είναι εάν αυτές οι περιφερειακές μεταβολές συνδέονται με σημεία νευροφλεγμονής ή / και με ενεργοποίηση μικρογλοίας.

Μαζί, αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η απώλεια ύπνου μπορεί να προκαλέσει AP και να οδηγήσει σε ενεργοποίηση μικρογλοίας. Εδώ δοκιμάσαμε αυτήν την υπόθεση χρησιμοποιώντας το SBEM για να μελετήσουμε τα PAP που περιβάλλουν τις συνάψεις των φλοιώδους ποντικού και μετρούν την εμφάνιση του AP μετά τον ύπνο, τον αυθόρμητο αφύπνιση και την απώλεια ύπνου. Στα φλοιώδη συναπτηνοευρώματα, αξιολογήσαμε επίσης αλλαγές στα επίπεδα πρωτεΐνης MERTK και την έκταση της υπεροξείδωσης λιπιδίων, η οποία μπορεί να οφείλεται σε υψηλό οξειδωτικό στρες και με τη σειρά της μπορεί να προκαλέσει φαγοκυττάρωση. Επιπλέον, μετρήσαμε την κατάσταση ενεργοποίησης μικρογλοίας και τη φαγοκυτταρική δραστηριότητα, καθώς και τα επίπεδα φλεγμονωδών δεικτών στο CSF των ποντικών μετά από ύπνο και απώλεια ύπνου. Διαπιστώνουμε ότι το ΑΡ, κυρίως των προσυναπτικών στοιχείων σε μεγάλες συνάψεις, εμφανίζεται μετά από οξεία και χρόνια απώλεια ύπνου αλλά όχι μετά από αυθόρμητη εγρήγορση, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να προωθήσει την καθαριότητα και την ανακύκλωση των φθαρμένων συστατικών των ισχυρών συνάψεων. Αντιθέτως, μόνο η απώλεια χρόνιου ύπνου ενεργοποιεί τα κύτταρα microglia και προάγει τη φαγοκυτταρική τους δραστηριότητα, προφανώς χωρίς εμφανή σημάδια νευροφλεγμονής, υποδηλώνοντας ότι η εκτεταμένη διακοπή του ύπνου μπορεί να προκαλέσει μικρογλοία και ίσως προδιαθέσει τον εγκέφαλο σε άλλες μορφές προσβολής.

Υλικά και μέθοδοι

Ζώα 

Ενήλικα ποντίκια 16g / Tg (Thy1-YFP) 16Jrs / J τεσσάρων εβδομάδων ηλικίας τεσσάρων εβδομάδων και των δύο φύλων χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη με εξαίρεση τα πειράματα microglia, στα οποία χρησιμοποιήθηκαν αρσενικά ποντίκια C57BL / 6J ηλικίας 4 εβδομάδων . Τα ποντίκια στεγάστηκαν σε κιβώτια εγγραφής για τη διάρκεια του πειράματος (κύκλος 12 ωρών φωτός / σκότους, φωτισμός στις 8:00 π.μ., 23 ± 1 ° C, διατροφή και νερό διαθέσιμο ad libitum και αντικατάσταση καθημερινά στις 8:00 π.μ.). Όλες οι διαδικασίες σε ζώα ακολούθησαν τον Εθνικό Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση Εργαστηριακών Ζώων και οι εγκαταστάσεις αναθεωρήθηκαν και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεραπείας και Χρήσης Θεσμικών Ζώων του Πανεπιστημίου του Wisconsin-Madison και επιθεωρήθηκαν και διαπιστεύθηκαν από την Ένωση Αξιολόγησης και τη διαπίστευση της εργαστηριακής φροντίδας των ζώων.

Πειραματικές συνθήκες και πρωτόκολλα για ύπνο, αυθόρμητη εγρήγορση και οξεία και χρόνια απώλεια ύπνου.

Τέσσερις πειραματικές συνθήκες χρησιμοποιήθηκαν ( Εικ. 1 Α): (1) ποντίκια που πέθαναν στον ύπνο (S) θανατώθηκαν κατά την διάρκεια της ελαφριάς φάσης, στο τέλος μιας μακράς περιόδου ύπνου (> 45 λεπτά, διακοπτόμενα από περιόδους επακόλουσης <4 λεπτών) και μετά την κατανάλωση τουλάχιστον 75% οι προηγούμενες 6-7 ώρες κοιμάται. (2) ποντικοί αυθόρμητα ξύπνιοι (W) θανατώθηκαν κατά τη διάρκεια της σκοτεινής φάσης, στο τέλος μιας μακράς περιόδου αφύπνισης (~ 1 ώρα, διακοπτόμενοι από περιόδους ύπνου <5 λεπτών) και μετά από τη δαπάνη τουλάχιστον 70% προηγούμενες 6-7 ώρες ξύπνιοι; (3) ποντικοί οξείας στέρησης ύπνου (SD) σκοτώθηκαν κατά την διάρκεια της ελαφριάς φάσης μετά από 8 ώρες στέρησης ύπνου που επιβλήθηκε με την εισαγωγή νέων αντικειμένων και με κτύπημα στον κλωβό κάθε φορά που τα ζώα εμφανίζονταν υπνηλία. Όπως αποδείχθηκε σε προηγούμενες μελέτες με εγγραφές EEG, αυτή η μέθοδος μπορεί να αποτρέψει τον ύπνο σχεδόν πλήρως για αρκετές ώρες [> 95% του συνολικού χρόνου που ξοδεύεται ξύπνιος ( Cirelli et al., 2004 ;Bellesi κ.ά., 2013 , 2015 )]. και (4) ποντίκια με χρόνιο ύπνο-περιορισμό (CSR) υποβλήθηκαν σε ομάδες (έξι έως οκτώ ποντικούς ανά ομάδα) σε 4,5 ημέρες χρόνιου περιορισμού ύπνου χρησιμοποιώντας ένα πρωτόκολλο βελτιστοποιημένο στο εργαστήριό μας. Μία προηγούμενη μελέτη επικύρωσης που χρησιμοποίησε ποντίκια εμφυτευμένα με ηλεκτρόδια EEG διαπίστωσε ότι αυτό το πρωτόκολλο CSR έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της συνολικής διάρκειας του ύπνου κατά ~ 70% ( de Vivo et al., 2016). Κατά τη διάρκεια του χρόνιου περιορισμού του ύπνου, τα ποντίκια στεγάστηκαν σε μεγάλους κλωβούς όπου, κατά τη διάρκεια της ημέρας, ο περιορισμός του ύπνου επιβλήθηκε χρησιμοποιώντας οικολογικά σχετικούς ερεθισμούς που περιελάμβαναν συνεχή έκθεση σε νέα αντικείμενα, αλλαγές κλωβού και κλινοστρωμνής, κοινωνική αλληλεπίδραση και ελεύθερη πρόσβα

Πειραματική διαδικασία

Τα ποντίκια S, W και SD τοποθετήθηκαν ξεχωριστά ξεκινώντας από τη μεταγεννητική ημέρα 27 (Ρ27) και σκοτώθηκαν στο Ρ30, και όλα αυτά εκτέθηκαν σε μερικά καινούρια αντικείμενα και είχαν πρόσβαση σε τροχούς κατά τη διάρκεια της σκοτεινής φάσης. Τα CSR ποντίκια υποβλήθηκαν σε περιορισμό ύπνου σε ομάδες (έξι έως οκτώ ποντικούς ανά ομάδα) από Ρ25 έως Ρ30. S, SD, και CSR ποντικοί θανατώθηκαν την ίδια ώρα της ημέρας (~ 4: 00 ΜΜ), ενώ το W ποντικοί θανατώθηκαν σε ~ 4: 00 πμ ( Εικ 1. Α ). Ανεξάρτητες ομάδες των S, SD και CSR ποντικών χρησιμοποιήθηκαν για υπερδομικές, μοριακές και ιστολογικές μελέτες (τα ποντίκια W χρησιμοποιήθηκαν μόνο για τις υπερδομικές μελέτες).

ΚΑΤΑΓΡΑΦΕΣ ΒΙΝΤΕΟ ΚΑΤΑΣΤΑΣΕΩΝ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑΣ.

Για να αποφευχθεί πιθανή βλάβη ιστού και φλεγμονή που προκύπτει από το εμφύτευμα ηλεκτροδίων EEG, οι καταστάσεις συμπεριφοράς σε ποντίκια S και W προσδιορίστηκαν με συνεχή παρακολούθηση βίντεο με υπέρυθρες κάμερες. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως ( Maret et al., 2011 , Bellesi et al., 2015 ), αυτή η μέθοδος υπολογίζει με συνέπεια τον συνολικό χρόνο ύπνου με ακρίβεια ≥90%, ακόμη και αν δεν μπορεί να διακρίνει τον ύπνο των κινήσεων από τον γρήγορο ύπνο των ματιών. Η δραστηριότητα των κινητήρων προσδιορίστηκε ποσοτικά από αλγόριθμους ανίχνευσης κίνησης βασισμένους σε βίντεο ( Bellesi et al., 2012 ).

 

ΜΕΛΕΤΕΣ ΥΠΕΡΔΟΜΗΣ.

Το σύνολο δεδομένων εικόνων που χρησιμοποιείται για την υπερδομική ανάλυση της αστροκυτταρικής ενδοκυττάρωσης είναι το ίδιο που χρησιμοποιήθηκε σε μια προηγούμενη μελέτη που χαρακτήριζε τη δυναμική των περιφερειακών αστροκυτταρικών διεργασιών (PAPs) σε S, W, SD και CSR ποντίκια ( Bellesi κ.ά., 2015 ) παρέχεται αναλυτική περιγραφή των μεθόδων (διάχυση, χρώση, απόκτηση και κατατομή). Εν συντομία, οι ποντικοί (τρία ζώα ανά ομάδα) εγχύθηκαν υπό βαθειά αναισθησία (3% ισοφλουράνιο). Ο ιστός βάφτηκε με διάλυμα 1.5% σιδηροκυανιούχου καλίου / τετροξείδιο 2% οσμίου, ακολουθούμενο από 1% θειοκαρβονυδραζίδιο, 2% τετροξείδιο οσμίου και 1% οξικό ουρανυλεστέρα στους 4 ° C. Την επόμενη ημέρα, ο ιστός χρωματίστηκε με ένα διάλυμα ασπαρτικού μολύβδου, αφυδατωμένο και ενσωματώθηκε με ρητίνη Durcupan και ταινία ACLAR. Μικρά τετράγωνα ιστού (1 mm ²) από μετωπιαίο φλοιό (πρόσθιο, 1,85 mm, μεσαίο, 1,5 mm) κολλώθηκαν στην άκρη μεταλλικού πείρου και επικαλύφθηκαν με χρώμα αργύρου για να ελαχιστοποιηθεί η φόρτιση των δειγμάτων κατά τη διάρκεια της απεικόνισης.

ΑΠΟΚΤΗΣΗ ΕΙΚΟΝΑΣ.

Οι εικόνες ελήφθησαν με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης εκπομπής πεδίου SIGMA VP (Carl Zeiss) εξοπλισμένο με τεχνολογία 3View (Gatan) και ανιχνευτή ηλεκτρονίων με αντίστροφη διάσπαση (για SBEM). Η σειρά των εικόνων υποβλήθηκε σε επεξεργασία και αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το TrakEM2, ένα FIJI plug-in ( Schindelin et al., 2012). Η τμηματοποίηση των αστροκυτταρικών προφίλ πραγματοποιήθηκε χειροκίνητα από δύο χειριστές τυφλούς στην πειραματική κατάσταση. Εντοπίστηκαν μικρές κυβοειδείς περιοχές ενδιαφέροντος (ROIs 5-6 μm ανά πλευρά) νευροπύλης (στρώματα II-III, μετωπιαίο φλοιό). Τα PAP αναγνωρίστηκαν με βάση τα διακριτικά τους σχήματα, αλληλεπιδρούν μεταξύ των νευρωνικών προφίλ και συχνά έρχονται σε επαφή με μέρη της συνάψεως και με την παρουσία κοκκίων γλυκογόνου. Οι ROI δεν περιλάμβαναν μεγάλους δενδρίτες ή σωμάτες νευρώνων, γλοίας ή ενδοθηλιακών κυττάρων. Για κάθε ROI υπολογίστηκε ο όγκος αστροκυττάρων και ο όγκος ROI. Η εμφάνιση του ΑΡ διαπιστώθηκε από την παρουσία ενός τμήματος του νευρικού άξονα, της κεφαλής της σπονδυλικής στήλης ή του δενδριδίου που εισέρχεται από το περιβάλλον PAP, με μια καθαρή συνέχεια μεταξύ του τμήματος που περικλείεται από το ΡΑΡ (φαγοσώμα) και τη νευρωνική δομή. Το ΑΡ προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας το ακόλουθο αποτέλεσμα: 1, φαγοκυττάρωση της κεφαλής της σπονδυλικής στήλης. 2, φαγοκυττάρωση του προσυναπτικού μπουτονιού. 3, φαγοκυττάρωση του άξονα (έξω από το αξονικό μπουτόν). 4, φαγοκυττάρωση του δενδριτικού άξονα. 5, φαγοκυττάρωση μιας άγνωστης δομής. Για τις συνάψεις των οποίων η αξονική κεφαλή ή η κεφαλή της σπονδυλικής στήλης εμπλέκονταν στο ΑΡ, η διασύνδεση αξόνων-σπονδυλικής στήλης (ASI) κατατμήθηκε με το χέρι και μετρήθηκε [όπως στην μελέτη μεBellesi et αϊ. (2015) ]. Μέσα στα PAP, τα ενδοσώματα που έδειξαν αδρανή, εν μέρει ή πλήρως αφομοιώσιμα υλικά βαθμολογήθηκαν ως πλήρη ενδοσώματα (FE), ανεξάρτητα από το εάν συντήχθηκαν ή όχι με λυσοσώματα, ενώ τα ενδοσώματα χωρίς κυστίδια βαθμολογήθηκαν ως κενά ενδοσώματα (EE).

Microarray: ανάλυση δεδομένων

Χρησιμοποιήσαμε τα δεδομένα microarray που είναι διαθέσιμα στη βάση δεδομένων NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE60079) για την ανάλυση γονιδιακής έκφρασης των δειγμάτων του εγκεφαλικού φλοιού που συλλέχθηκαν από τον ύπνο (6-7 ώρες ύπνου κατά την διάρκεια της φάσης φωτός), ξύπνιοι (6-7 ώρες της αυθόρμητης αφύπνισης τη νύχτα) και αναγκασμένη εμπλουτισμένη αφύπνιση (4 ώρες στέρησης ύπνου μέσω έκθεσης σε νέα αντικείμενα κατά τη διάρκεια της φάσης φωτός) ποντικών. Λεπτομερείς μέθοδοι περιγράφηκαν από τους Bellesi et αϊ. (2015). Εν συντομία, συλλέχθηκαν δείγματα (έξι για κάθε κατάσταση συμπεριφοράς) με τη χρήση της μεθοδολογίας καθαρισμού με συγγένεια με γενετικά στοχευμένη μετάφραση ριβοσώματος από βακτηριακά τεχνητά χρωμοσωμικά διαγονιδιακά ποντίκια που εκφράζουν ριβοσωματική πρωτεΐνη L10a με σήμανση EGFP σε αστροκύτταρα. Τα δείγματα ανοσοκαταβυθίστηκαν για την απομόνωση αστροκυττάρων. Το κατακρημνισμένο τμήμα σχημάτισε το δεσμευμένο (ΙΡ) δείγμα που περιείχε αστροκύτταρα και το υπόλοιπο τμήμα σχημάτισε το μη δεσμευμένο δείγμα (UB) που περιείχε όλους τους υπόλοιπους κυτταρικούς τύπους (νευρώνες και άλλα κύτταρα γλοίας). Στη συνέχεια, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία τόσο τα δείγματα IP όσο και τα δείγματα UB, και το RNA εξήχθη και εκτελέστηκε σε συστοιχίες Affymetrix GeneChip Mouse Genome 430 2.0. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήσαμε στοιχεία πίνακα που ελήφθησαν από τα δείγματα ΙΡ και συγκρίναμε το S έναντι W και S έναντι ποντικών SD. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε κάθε ομάδα συμπεριφοράς κατάστασης χρησιμοποιώντας το Robust Average Multiarray Average.t με Benjamini και Hochberg FDR διόρθωση πολλαπλών δοκιμών. Όλα τα σύνολα ανιχνευτών με αλλαγή πτυχής> 30% και ρ <0.01 θεωρήθηκαν ότι εκφράζονται διαφορικά.

ΠΑΡΑΣΚΕΥΑΣΜΑΤΑ ΣΥΓΧΩΝΕΥΟΝΕΥΡΩΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΣΤΥΠΩΜΑ WESTERN.

Κάτω από την αναισθησία, ποντίκια (τέσσερα S, τέσσερα SD, τέσσερα CSR) αποκεφαλίστηκαν και ο εγκεφαλικός φλοιός (συμπεριλαμβανομένου του ραβδωτού σώματος) συλλέχθηκε γρήγορα. Τα δείγματα ομογενοποιήθηκαν σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης [10 m m HEPES (Sigma), 1,0 m m EDTA (Promega), 2,0 m m EGTA (Thermo Fisher Scientific), 0,5 m m DTT (Invitrogen), 0,1 m m PMSF (Fluka ), 10 mg / L λευπεπτίνη (Sigma), 50 mg / L αναστολέα θρυψίνης σόγιας (Roche), και 100 n mmicrocystin (Alexis)] με τη χρήση ενός ομογενοποιητή υάλου / γυάλιου ιστού (Kontes). Ένα κλάσμα (~ 10%) του ομογενοποιημένου από κάθε δείγμα βράστηκε σε 10% SDS για 10 λεπτά και αποθηκεύτηκε χωρίς επεξεργασία στους -80 ° C. Το υπόλοιπο κλάσμα του ομογενοποιήματος διαβιβάστηκε μέσω δύο φίλτρων με πλέγμα νάιλον των 105 μm (Μικρά Μέρη), κατόπιν μέσω ενός φίλτρου πόρου 5 μm (Millipore) και φυγοκεντρήθηκε στα 1000 χ gγια 10 λεπτά στους 4 ° C. Τα σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν σε 1% SDS, βράστηκαν για 10 λεπτά και φυλάχθηκαν στους -80 ° C. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία δικινχονικού οξέος (Pierce). Εφόσον οι πρωτεΐνες νοικοκυριού (π.χ. α-ακτίνη και β-τουμπουλίνη) μπορούν να επηρεαστούν από τον ύπνο και την αφύπνιση, δεν χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικό πρότυπο. Αντ 'αυτού, για αμφότερα τα ομογενοποιημένα και τα συντανοευρουσώματα, ίσες ποσότητες πρωτεΐνης συγκεντρώθηκαν από κάθε επιμέρους ζώο σε κάθε ομάδα. Οι ομάδες S, SD και CSR (τέσσερις ποντικοί ανά ομάδα) φορτώθηκαν επί των ίδιων πηκτωμάτων σε τρία έως έξι αντίγραφα (η φόρτωση δειγμάτων τυχαιοποιήθηκε). Η όλη διαδικασία, από την προετοιμασία της πισίνας έως τη φόρτωση δειγμάτων, επαναλήφθηκε τέσσερις φορές. Σε κάθε πείραμα, ισοδύναμες ποσότητες (5 μg για GFAP, 10 μg για MERTK, 20 μg για C3) ομογενοποιημένου / συντανοευροσωμικού από S, SD, και οι ομάδες CSR διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής Tris-HCI (Bio-Rad). Οι μεμβράνες νιτροκυτταρίνης ανιχνεύθηκαν με αντισώματα αντι-ΟΡΑΡ (1: 500, Sigma), αντι-ΜΕΡΤΚ (1: 500, R & D Systems, AF591) ή αντι-C3 (1: 500, Cappel Laboratories). Μετά την έκθεση σε δευτερεύοντα αντισώματα, οι ζώνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL-Prime, GE Healthcare) και συλλήφθηκαν από τον ανιχνευτή μεταβλητού τρόπου Typhoon 9410 (GE Healthcare). Οι οπτικές πυκνότητες υπολογίστηκαν για κάθε ζώνη ενδιαφέροντος μετά από διόρθωση υποβάθρου (αφαιρώντας την τιμή μιας ζώνης αμέσως πάνω από την ενδιαφέρουσα ζώνη στην ίδια λωρίδα) και κανονικοποιήθηκαν σε κάθε πείραμα με τη μέση πυκνότητα των δειγμάτων S. Cappel Laboratories) αντισώματα. Μετά την έκθεση σε δευτερεύοντα αντισώματα, οι ζώνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL-Prime, GE Healthcare) και συλλήφθηκαν από τον ανιχνευτή μεταβλητού τρόπου Typhoon 9410 (GE Healthcare). Οι οπτικές πυκνότητες υπολογίστηκαν για κάθε ζώνη ενδιαφέροντος μετά από διόρθωση υποβάθρου (αφαιρώντας την τιμή μιας ζώνης αμέσως πάνω από την ενδιαφέρουσα ζώνη στην ίδια λωρίδα) και κανονικοποιήθηκαν σε κάθε πείραμα με τη μέση πυκνότητα των δειγμάτων S. Cappel Laboratories) αντισώματα. Μετά την έκθεση σε δευτερεύοντα αντισώματα, οι ζώνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (ECL-Prime, GE Healthcare) και συλλήφθηκαν από τον ανιχνευτή μεταβλητού τρόπου Typhoon 9410 (GE Healthcare). Οι οπτικές πυκνότητες υπολογίστηκαν για κάθε ζώνη ενδιαφέροντος μετά από διόρθωση υποβάθρου (αφαιρώντας την τιμή μιας ζώνης αμέσως πάνω από την ενδιαφέρουσα ζώνη στην ίδια λωρίδα) και κανονικοποιήθηκαν σε κάθε πείραμα με τη μέση πυκνότητα των δειγμάτων S.

ΥΠΕΡΟΞΕΙΔΩΣΗ ΤΩΝ ΛΙΠΙΔΙΩΝ.

Η υπεροξείδωση των λιπιδίων αξιολογήθηκε σε φλοιώδη συναπτωνευρωσώματα ποντικών S ( η = 7), SD ( η = 8) και CSR ( η = 7) χρησιμοποιώντας το κιτ προσδιορισμού λιπιδίων υπεροξείδωσης (MDA) (ab118970, Abcam). Αυτός ο προσδιορισμός παρέχει μια εκτίμηση του τελικού προϊόντος [μηλονική αλδεΰδη (MDA)] υπεροξείδωσης λιπιδίων. Υποπολλαπλάσια συνυπνοευρωσωμάτων (200 μΐ) επωάσθηκαν με θειοβαρβιτουρικό οξύ (TBA) στους 95 ° C για 60 λεπτά για να παραχθεί μια προσαγωγή MDA-TBA, η οποία ποσοτικοποιήθηκε χρωματομετρικά (OD, 532 nm) χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών.

ΕΚΧΥΛΙΣΗ CSF ΚΑΙ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ΠΟΛΛΑΠΛΗΣ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΣΗΣ LUMINEX.

Υπό αναισθησία, S ( η = 11), SD ( η = 10) και CSR ( n= 8) ποντίκια τοποθετήθηκαν σε μια στερεοταξική συσκευή, ενώ οι μηνύσεις πάνω από το cisterna magna εκτέθηκαν και η γύρω περιοχή πλύθηκε ήπια για να αποφευχθεί η μόλυνση του αίματος. Χρησιμοποιήθηκε ένας μικρός γυάλινος τριχοειδής σωλήνας για τη διάτρηση της αραχνοειδούς μεμβράνης που καλύπτει το cisterna magna και συλλέγει το CSF με τριχοειδή δράση. Περίπου 10 μΐ CSF ελήφθησαν από κάθε ποντικό και αποθηκεύθηκαν αμέσως στους -80 ° C. Οι συγκεντρώσεις κυτοκίνης και χημειοκίνης μετρήθηκαν σε μια πολλαπλή δοκιμασία Luminex, δηλ., Η δοκιμασία κυτταροκινών 23 πλέγματος Bio-Plex Pro (Bio-Rad). Τα μεμονωμένα δείγματα CSF αραιώθηκαν σε όγκο όγκου 50 μΐ και επωάστηκαν με ένα εναιώρημα μικροσφαιριδίων συζευγμένων με αντίσωμα συζευγμένου αντισώματος, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από περαιτέρω επώαση με βιοτινυλιωμένα αντισώματα ανίχνευσης και στρεπταβιδίνη συζευγμένη με φυκοερυθρίνη (ΡΕ) φθορίζον σήμα αναγιγνώσκεται σε συσκευή ανάγνωσης Multiplex Reader Luminex MAGPIX (Bio-Rad). Μια πενταπαραμετρική λογική καμπύλη που δημιουργήθηκε από πρότυπα γνωστής συγκέντρωσης χρησιμοποιήθηκε για τη μετατροπή της έντασης φθορισμού σε τιμές συγκέντρωσης, οι οποίες στη συνέχεια προσαρμόστηκαν για αραίωση δείγματος. Τα αναλυθέντα μόρια ήταν τα IL1a, IL1b, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL9, IL10, IL12 (ρ40), IL12 (ρ70), IL13, IL17a, Eotaxin, G-CSF, GM- MCP1, MIP1a, MIP1b, RANTES και TNFa.

ΑΝΟΣΟΚΥΤΤΑΡΟΧΗΜΕΙΑ.

S ( η = 6), SD ( η = 5) και CSR ( n= 6) ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν βαθιά με ισοφλουράνιο (όγκος 1-1,5%) και διαχύθηκαν διακαρδίως με έκπλυση (~ 30 s) φυσιολογικού ορού, ακολουθούμενο από 4% παραφορμαλδεΰδη σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα. Οι εγκέφαλοι απομακρύνθηκαν, τοποθετήθηκαν στο ίδιο σταθεροποιητικό μέσο όλη τη νύκτα και κόπηκαν σε δονητό σε 50 μm στεφανιαία τμήματα. Οι τομές ξεπλύθηκαν σε διάλυμα αποκλεισμού (BSA) και 0.3% Triton Χ-100 για ΙΒΑ-1 και V-GLUT1, 2% BSA και 0.2% Triton Χ-100 για MERTK) (1: 500, κατάλογος # 019-19741, Wako), αντι-VGLUT-1 (1: 1000, ab5905, Millipore) ή αντι-ΜΕΡΤΚ (1: 100, AF591, R & D Systems). Εν συνεχεία τα τμήματα ανιχνεύθηκαν με δευτερογενή αντισώματα: δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με Alexa Fluor 568 (1: 500, Invitrogen) - και / ή Alexa Fluor 488 (1: 500, Invitrogen). Για τη χρώση με MERTK, (1: 100, Vector Laboratories) και το κιτ TSA # 22, με HRP-στρεπταβιδίνη και Alexa Fluor 488 Tyramide (Τ-20932). μετά την ενίσχυση, τα τμήματα επωάστηκαν με αντισώματα αντι-ΟΡΑΡ (1: 100, Sigma, κατά τη διάρκεια της νύχτας στους 4 ° C) και ανιχνεύθηκαν με Alexa Fluor 568 (1: 500, Invitrogen). Οι τομές εξετάσθηκαν με ένα ομοιοπολικό μικροσκόπιο (Prairie Technologies). Για τον IBA-1, τα μικροσκοπικά πεδία (n = 5 ανά τμήμα, 3 τμήματα ανά ποντικό) αποκτήθηκαν τυχαία ως εικόνες 512 Χ 512 εικονοστοιχείων (μέγεθος εικονοστοιχείου, 581 nm, βήμα Ζ, 750 nm) σε μετωπικό φλοιό ποντικού χρησιμοποιώντας αντικειμενικό UPlan FL N 40 × (αριθμητικό άνοιγμα, 1.3). Για να βελτιωθεί ο λόγος σήματος / θορύβου, λήφθηκαν κατά μέσον όρο δύο καρέ από κάθε εικόνα. Για το ΙΒΑ-1 / VGLUT-1, τα μικροσκοπικά πεδία ( n = 5 ανά τμήμα, 3 τμήματα ανά ποντίκι) αποκτήθηκαν τυχαία ως εικόνες 1024x1024 εικονοστοιχείων (μέγεθος εικονοστοιχείου, 65 nm, ψηφιακό ζουμ, 3χ) ένα αντικείμενο UPlan FL N 60 × (αριθμητικό διάφραγμα, 1.3).

ΑΝΑΛΥΣΗ ΕΙΚΟΝΑΣ.

Για την βαφή IBA-1, όλες οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε προβολές μέγιστης έντασης (Z-project, Μέγιστη ένταση συνάρτησης στο ImageJ) των 28 εικόνων που αποτελούν τη στοίβα Ζ. Η καταμέτρηση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε χειροκίνητα από δύο χειριστές τυφλούς στις πειραματικές συνθήκες χρησιμοποιώντας το plugin μέτρησης κυττάρων του FIJI. Για τη μορφολογική ανάλυση της μικρογλοίας εφαρμόστηκαν δύο μέθοδοι.

Η μέθοδος 1 προσαρμόστηκε από τους Morrison και Filosa (2013) και συνίστατο στην ανάλυση του σκελετού των διαδικασιών μικρογλοίας. Εν συντομία, ο θόρυβος του φόντου των εικόνων προβολής Z μειώθηκε χρησιμοποιώντας τη λειτουργία "Despeckle" στο FIJI. Στη συνέχεια, οι εικόνες ήταν δυαδικές, σκελετοποιημένες και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το plugin FIJI "Analyze Skeleton". Το μήκος του κλάδου και ο αριθμός των τελικών σημείων (άκρα) διαιρέθηκαν στη συνέχεια με τον αριθμό των κυψελών somas ανά πλαίσιο για να ληφθούν κανονικοποιημένες τιμές. Η μέθοδος 2 προσαρμόστηκε από τους Kozlowski και Weimer (2012): οι εικόνες έγιναν αρχικά κατώφλι με τη χρήση της λειτουργίας "Graythresh" μέσα στο MATLAB και ταυτοποιήθηκαν αντικείμενα μεγέθους μεταξύ 200 και 1500 εικονοστοιχείων, που αντιστοιχούν σε υποτιθέμενα μικρογλοιακά κύτταρα. Για την ανάλυση μεμονωμένων κυττάρων, το κεντροειδές (κέντρο μάζας) για κάθε ένα από αυτά τα αντικείμενα υπολογίστηκε και χρησιμοποιήθηκε για την καλλιέργεια ενός ROI 110 × 110 pixel γύρω από κάθε κύτταρο. Κάθε κυτταρική μάσκα εξετάστηκε οπτικά για να επιβεβαιωθεί ότι ένα μοναδικό μικρογλοιακό κύτταρο αναπαρίστατο με ακρίβεια στη μάσκα. Οι εικόνες στις οποίες το κελί άγγιξε το όριο της εικόνας ή οι εικόνες που δεν περιείχαν ένα μόνο κύτταρο, δεν εξετάστηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Συνολικά, 5129 από 8653 μικρογλοιακά κύτταρα πληρούσαν τα κριτήρια συμπερίληψης και στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη λειτουργία "Regionprops" στο MATLAB για να ληφθεί μια εκτίμηση της περιμέτρου και της περιοχής κυττάρων. Η φαγοκυττάρωση Microglia ποσοτικοποιήθηκε στις διπλά χρωματισμένες εικόνες ΙΒΑ-1 / VGLUT-1. Για να βελτιστοποιηθεί η ανίχνευση του VGLUT-1-θετικού σημείου που απορροφήθηκε εντός της μικρογλοιάς, επεξεργάστηκαν ξεχωριστά τα κανάλια πράσινου (ΙΒΑ-1) και κόκκινου (VGLUT-1). Ο θόρυβος του πράσινου καναλιού μειώθηκε με τη χρήση της συνάρτησης "Αφαίρεση φόντου" (ακτίνα σφαίρας σφαίρας, 50 pixel) στο FIJI. Στη συνέχεια η εικόνα διηθήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο υστέρησης 3D, 1, ακολουθούμενο από ένα 3D διάμεσο φίλτρο2 στο Matlab. Ο θόρυβος υποβάθρου του κόκκινου καναλιού μειώθηκε με τη χρήση της συνάρτησης Αφαίρεση φόντου (ακτίνα σφαίρας κύλισης, 2 εικονοστοιχεία) και Despeckle σε FIJI. Η εικόνα στη συνέχεια φιλτράρεται μέσω ενός 3D Μέγιστου Φίλτρου (ακτίνα, 3 εικονοστοιχεία σε κάθε διάσταση), αυτόματα κατωφλιού (μέθοδος "Αυτόματη Κατώτατη", "Προεπιλεγμένη") και κατακερματισμένη χρησιμοποιώντας τη λειτουργία "Watershed". Στη συνέχεια, τα πράσινα και κόκκινα κανάλια επανεμφανίστηκαν. Μόνο VGLUT-1 θετικά σημεία μεγαλύτερα από 100 pixel (~ 0,03 μm³ ) σε xyz και παρουσιάζοντας 100% επικάλυψη με το επεξεργασμένο σήμα ΙΒΑ-1, ποσοτικοποιήθηκαν.

Αποτελέσματα

Η απώλεια ύπνου ενισχύει τη φαγοκυττάρωση των αστροκυττάρων

Για να μελετηθεί η εμφάνιση αστροκυτταρικής φαγοκυττάρωσης στο φλοιώδες νευροπίλλων, τα τρισδιάστατα ROI χωρίστηκαν με το χέρι και αναλύθηκαν σε στρώματα ΙΙ / ΙΙΙ του μετωπιαίου φλοιού ποντικού, σε ποντίκια που κοιμήθηκαν, ήταν αυθόρμητα ξύπνια ή είχαν στέρηση οξείας ή χρόνιας ύπνου ( Σχ. 1 Α · τρεις ποντικοί ανά ομάδα · αριθμός ROI: S, 295 · W, 266 · SD, 355 · CSR, 280). Η ποσότητα που αναλύθηκαν νευροπιλήματος ήταν παρόμοιο σε συνθήκες [> 1 mm πλάτους ³ ? Δοκιμή Kruskal-Wallis (KW), ρ = 0,45. Σχ. 1 Β ]. Οι τέσσερις ομάδες επίσης δεν διέφεραν στον εξεταζόμενο όγκο αστροκυττάρων (δοκιμασία KW, σ= 0.11, τα δεδομένα δεν φαίνονται) ούτε στη μέση συνοπτική πυκνότητα ανά ROI (αριθμός συνάψεων / ROI: S, 2.81, W, 3.03, SD, 2.93, CSR, 2.74). Τα PAP αναγνωρίστηκαν εύκολα λόγω των μορφολογικών τους χαρακτηριστικών (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι) και εντός των ΡΑΡ, το ΑΡ αναγνωρίστηκε δομικά από την παρουσία ενός τμήματος κεφαλής σπονδυλικής στήλης, αξόνων ή δενδριτών περιβαλλόμενων από το ΡΑΡ, με μια σαφή συνέχεια μεταξύ του τμήματος που περικλείονται από το PAP (φαγοσώμη) και τη δομή νευρώνων (βλέπε σχήμα 1 Γ για παράδειγμα). Αθροιστική ανάλυση κατανομής όλων των καταχωρισμένων ROI (S: n = 289 · W: n = 266 · SD: n = 355 · CSR: n= 280) έδειξε ότι σε όλα τα ποντίκια το ΑΡ επηρέασε μόνο μια μικρή μειοψηφία των συνάψεων, αλλά άλλαξε σε όλες τις πειραματικές συνθήκες (δοκιμασία KW, p <0,0001). Συγκεκριμένα, η AP εμφανίστηκε συχνότερα σε ποντίκια CSR και SD από ό, τι σε ποντικούς S (ποσοστό όλων των συνάψεων εντός του ROI: CSR, 13,5%, W, 7,3%, SD, 8,4%, S, 5,7% vs S, ρ <0,0001, SD έναντι S, ρ = 0,0076, CSR έναντι SD, ρ = 0,026, Σχήμα 1D ). Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι η εμφάνιση AP σε ποντίκια W ήταν συγκρίσιμη με ποντίκια S (πολλαπλή δοκιμή σύγκρισης Dunn, ρ = 0,12) και σημαντικά διαφορετική από τα CSR ποντίκια (πολλαπλή δοκιμή σύγκρισης Dunn, p= 0,005) αλλά όχι από SD ποντίκια (πολλαπλή δοκιμή σύγκρισης Dunn, ρ = 0,9, Εικόνα 1D ), υποδηλώνοντας ότι η αύξηση του ΑΡ σχετιζόταν με απώλεια ύπνου και όχι μόνο με την κατάσταση εγρήγορσης. Σημειώστε ότι η αύξηση του AP μετά την απώλεια του ύπνου είναι απίθανο να εξηγηθεί από την έκθεση σε νέα αντικείμενα και τροχούς κατά τη διάρκεια οξείας και χρόνιας στέρησης ύπνου, επειδή ποντίκια S και W επίσης εκτέθηκαν στα ίδια ερεθίσματα κατά τη διάρκεια της σκοτεινής φάσης. Περαιτέρω ανάλυση των ειδικών δομών της νευροπύλης που εμπλέκονται στο ΑΡ αποκάλυψε ότι οι νευρώνες και οι αξονικοί μπουτόνι αντιπροσώπευαν το ~75% όλων των φαγοκυττάρων και οι κεφαλές της σπονδυλικής στήλης για ~ 18-20% όλων των φαγοκυττάρων ( Σχήμα 1 Δ). Τα συστατικά που δεν μπορούσαν να ταυτιστούν ήταν σπάνια και τμήματα των δενδριτικών φρεατίων δεν παρατηρήθηκαν σχεδόν ποτέ ( Εικ. 1 Δ ). Παρά τη μεταβολή του απόλυτου αριθμού των συνάψεων που εμπλέκονται σε AP (συνάψεις AP +), η αναλογία των αξόνων και των μπουτονιών σε σχέση με τις κεφαλές της σπονδυλικής στήλης διατηρήθηκε κυρίως στις τέσσερις συνθήκες (S, W, SD, CSR). ένα σύνολο, χωρίς συγκεκριμένες επιδράσεις σε επιλεγμένα συστατικά της νευροπύλης.

http://www.jneurosci.org/content/jneuro/37/21/5263/F1.medium.gif 

Λήψη αριθμού  |  Ανοίξτε σε νέα καρτέλα  |  Κάντε λήψη του powerpoint

Σχήμα 1.

Η απώλεια ύπνου προωθεί την AP. Α , Πειραματικό σχέδιο. B , Όγκος όλων των ROI που αναλύθηκαν σε ποντίκια S ( n = 295), W ( n = 266), SD ( n = 355) και CSR ( n = 280). Οι μαύρες γραμμές απεικονίζουν το μέσο όρο και το SD. C , Παράδειγμα AP όπως απεικονίζεται σε δισδιάστατες εικόνες SBEM (αριστερά) και 3D ανακατασκευή του (δεξιά). Γραμμή κλίμακας: 200 nm. D , Αριστερά, Αριθμός συναπτικών στοιχείων φαγοκυττάρων από αστροκύτταρα σε S, W, SD και CSR ποντίκια. Οι τιμές (μέσος όρος ± SEM) εκφράζονται ανά κυβικό χιλιοστό του αστροκυτταρικού όγκου. * ρ<0,05; ** ρ <0,01; *** σ<0,001. Δεξιά, ανάλυση συχνότητας καταστροφής των δομών νευροπύλης που εμπλέκονται στο ΑΠ για S, W, SD και CSR. E , ASI μέγεθος όλων των συνόλων S, W, SD και CSR AP + σε σχέση με το μέσο μέγεθος ASI (διακεκομμένη γραμμή) σε τυχαίο δείγμα συνάψεων (S, n = 302, W, n = 256, SD, n = 345; CSR, η = 296). F , Παράδειγμα ενός προσυναπτικού μπουτόν (κίτρινο) που περιέχει ένα μιτοχόνδριο (αστερίσκο) και είναι φαγοκυττάρων από ένα PAP (μπλε). Γραμμή κλίμακας, 400 nm. G , Ποσοστό προσυναπτικών μπουτονιών που περιέχουν μιτοχόνδριο που είναι (μπλε ράβδοι) ή δεν είναι (πράσινες ράβδοι) που εμπλέκονται σε ΑΡ σε S, W, SD και CSR ποντίκια. H, Παραδείγματα FE (αστερίσκο, αριστερά) και EE (αστερίσκος, δεξιά). Γραμμή κλίμακας, 130 nm. Εγώ , 3D ανακατασκευή ενός EE (κόκκινο). Σημειώστε τη σωληνοειδή δομή του μέσα στο PAP (ανοικτό μπλε). J , Αριθμός EE και FE (μέσος όρος ± SEM) ανά κύβος χιλιοστόμετρου αστροκυτταρικού όγκου σε S, W, SD και CSR ποντίκια.

Κατά την πρώιμη ανάπτυξη, το ΑΡ μεσολαβεί στην εξάλειψη ασθενών συνάψεων στον πλευρικό πυρήνα γονιδιώματος ( Chung et al., 2013 ). Δεδομένης της συσχέτισης μεταξύ της συναπτικής αντοχής και του μεγέθους ( Holtmaat και Svoboda, 2009 ), μετρήσαμε το μέγεθος των συνόλωνAP + για να ελέγξουμε αν οι μικρές συνάψεις ήταν πιο συχνά φαγοκυττάρων από τα PAPs. Θεωρήσαμε όλες τις συνάψεις των οποίων η κεφαλή σπονδυλικής στήλης ή η κεφαλή της σπονδυλικής στήλης ήταν φαγοκυττάρων και μέτρησαν το ASI τους, ένα αξιόπιστο μέτρο της συναπτικής δύναμης που είναι επίσης πολύ συσχετισμένο με τον όγκο της κεφαλής της σπονδυλικής στήλης ( Desmond and Levy, 1988). Το AP που περιλαμβάνει άλλα συστατικά εκτός της συνάψεως (άξονες, δενδρίτες και άγνωστοι) δεν εξετάστηκε σε αυτή την ανάλυση. Διαπιστώσαμε ότι σε όλες τις ομάδες, η ASI των συνάψεων ΑΡ + ήταν μεγαλύτερη από το μέσο μέγεθος ASI [Mann-Whitney U (MW) test, p <0,01] υπολογιζόμενη από μια ομάδα συνάψεων τυχαία επιλεγμένων στις S ( n = 302 συνάψεις) , W ( n = 256), SD ( n = 345) και σύνολα δεδομένων CSR ( n = 296). Έτσι, ανεξάρτητα από την κατάσταση συμπεριφοράς, οι μεγάλες συνάψεις ήταν πιο πιθανό να παρουσιάζουν ΑΡ από συνάψεις μεσαίου ή μικρού μεγέθους. Επίσης, ποσοτικοποιήσαμε την επικράτηση των αξονικών μπουτονιών που περιέχουν ένα ή περισσότερα μιτοχόνδρια σε συνάψεις AP + και ΑΡ- συγκρίσιμου μεγέθους (τα μιτοχόνδρια είναι σπάνια στις κεφαλές της σπονδυλικής στήλης.Sorra and Harris, 2000 ). Όπως και πριν, οι συνάψεις AP επιλέχθηκαν από μία ομάδα συνάψεων τυχαία επιλεγμένων από τα σύνολα δεδομένων S ( n = 216 συνάψεις), W ( n = 206), SD ( n = 301) και CSR ( n = 203). Σε ποντίκια S και SD, παρατηρήθηκε ισχυρή τάση προς την αύξηση του αριθμού των αξονικών μπουτονιών με μιτοχόνδρια σε συνάψεις ΑΡ + σε σχέση με τις ΑΡ-συνάψεις (ΑΡ + έναντι ΑΡ-: S, 57,2% έναντι 36,6%, SD, 50% έναντι 39,2 %). Ωστόσο, η ακριβής δοκιμασία του Fisher δεν έφθασε σε σημαντικό βαθμό (S, p = 0,098, SD, p = 0,22) και δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές στο W (AP + έναντι ΑΡ-: W, 45,7% έναντι 43,7%, ρ = 0,86) CSR (ΑΡ + έναντι ΑΡ-: 38,3% έναντι 40,9%, ρ = 0,87, Σχήμα 1G ).

Σε ~ 30% των ROIs, τα PAP περιείχαν ενδοσώματα, τα οποία ορίστηκαν ως κυτταροπλασματικά μεμβρανώδη οργανίδια διαφόρων μεγεθών. Για να επαληθεύσουμε εάν ο αριθμός τους επηρεάστηκε από πειραματικές συνθήκες, σχολιάσαμε την παρουσία τους κατά την αξιολόγηση του ΑΠ. Δεδομένου ότι ήταν πολύ δύσκολο να διακρίνουμε οπτικά τα ενδοσώματα με βάση τους διαφορετικούς τύπους εγκλεισμάτων, όπως το αδιαφορούμενο απορροφούμενο συναπτικό υλικό ή το μερικώς χωνευμένο υλικό, θεωρήσαμε όλα τα ενδοσώματα που περιέχουν κάποιο υλικό ως FE ( Σχήμα 1 Η , αριστερά), ενώ τα ενδοσώματα χωρίς το υλικό βαθμολογήθηκε ως ΕΕ ( Σχήμα 1 Η , δεξιά). Αξίζει να σημειωθεί ότι, συχνά EE φάνηκε να σχηματίσει ένα σύμπλοκο σωληνοειδή δομή εντός του ΡΑΡ στο 3D ανακατασκευή ( Εικ. 1 Ι). Αν και ο αριθμός των FE δεν μεταβλήθηκε σημαντικά σε όλη πειραματικές συνθήκες (δοκιμή KW, ρ = 0.13), ο αριθμός των EE έδειξαν μια μεγάλη αύξηση στην S ποντίκια σε σχέση με SD (δοκιμή MW, ρ <0,0001) και CSR (δοκιμή MW, σ<0,0001) ποντικούς. Η πυκνότητα του EE σε ποντικούς W ήταν διαφορετική από ποντικούς S (δοκιμασία MW, ρ = 0,045), αλλά επίσης από ποντίκια SD (MW δοκιμή, ρ = 0,006) και CSR (δοκιμασία MW, ρ = 0,0002) ( Εικόνα 1 J ).

Η απώλεια ύπνου αυξάνει την έκφραση του MERTK

Σε μια πρόσφατη μελέτη σε ποντίκια Aldh1L1-eGFP-L10a χρησιμοποιήσαμε τη μετάφραση τεχνολογίας καθαρισμού συγγένειας ριβοσώματος και μικροσυστοιχιών για την ταυτοποίηση αστροκυτταρικών γονιδίων των οποίων η έκφραση επηρεάζεται από τον κύκλο ύπνου / αφύπνισης και βρήκε Mertk μεταξύ των γονιδίων "ξυπνούν", ρυθμισμένα προς τα πάνω τόσο σε αυθόρμητη εγρήγορση και οξεία στέρηση ύπνου σε σχέση με τον ύπνο ( Bellesi κ.ά., 2015 ). Εδώ τα ίδια σύνολα δεδομένων (NCBI GEO accession number GSE69079 ) διερευνήθηκαν με σύγκριση του S είτε με αναγκαστική εγρήγορση είτε με αυθόρμητο εγχείρημα, για να προσδιοριστεί αν μεταξύ των προηγουμένως ταυτοποιημένων μεταγραφών αστροκυττάρων που εμπλέκονται στη φαγοκυττάρωση ( Cahoy et al., 2008) μερικοί επηρεάστηκαν ειδικά από την οξεία απώλεια ύπνου αλλά όχι από αυθόρμητη εγρήγορση. Βρήκαμε ελάχιστες ενδείξεις για επιπλέον ενεργοποίηση των φαγοκυτταρικών γονιδίων σε αναγκάζονται πέρασμά σχέση με αυθόρμητη wake: Mertk έδειξε μια παρόμοια αύξηση και στις δύο συγκρίσεις (S vs W, ρ = 0.005? S vs SD, ρ = 0,003? Σχήμα 2. Α ), και gas6 , ο συνδέτης MERTK, έδειξε επίσης μια παρόμοια τάση προς μία αύξηση (αμφότερα ρ = 0,06? το Σχ. 2 Α ). Η μόνη διαφορά ήταν ο crk , του οποίου η πρωτεΐνη αλληλεπιδρά με το DOCK1, το downstream μονοπάτι του MERTK, το οποίο τείνει να αυξάνει ( p = 0,06) μόνο μετά από αναγκαστική εγρήγορση και το Itgb2, η οποία αντίθετα αυξήθηκε ( p = 0,014) μόνο μετά από αυθόρμητη εγρήγορση ( Εικόνα 2 Α ). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι αρκετές ώρες αφύσσης επαρκούν για να ενεργοποιήσουν τη διαδρομή MERTK, ακόμη και χωρίς απώλεια ύπνου. Για να επαληθεύσουμε αν η Mertk ρυθμίστηκε προς τα πάνω και σε πρωτεϊνικό επίπεδο, πρώτα διπλασιάσαμε τις χρωματισμένες στεφανιαίες τομές του μετωπιαίου φλοιού με αντισώματα έναντι των MERTK και GFAP, ενός καλά αναγνωρισμένου δείκτη για τα αστροκύτταρα. Επιβεβαιώσαμε ότι αρκετές αστροκυτταρικές διεργασίες ήταν θετικές με MERTK ( Εικόνα 2 Β ), όπως περιγράφηκε προηγουμένως ( Chung et al., 2013). Στη συνέχεια, για να εκτιμήσουμε το επίπεδο έκφρασης MERTK σε κοντινά συνάψεις, ετοιμάσαμε φλοιώδη συναπτωνευροσωμάτια από S, SD και CSR ποντίκια και μετά τον έλεγχο ότι τα συνυπνοευρωσώματα εξακολουθούσαν να περιέχουν περιισυναπτικά γλοία χρησιμοποιώντας τον αστροκυτταρικό δείκτη GFAP ( Εικόνα 2C , επάνω) Έκφραση πρωτεΐνης MERTK ( Σχήμα 2 C , κάτω). Ποσοτική ανάλυση ανοσοκηλίδος έδειξε ότι τόσο SD (τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Dunn, ρ <0.05) και CSR (τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Dunn, ρ <0.05) σχετίστηκαν με υψηλότερα επίπεδα MERTK σχετικά με το S, και η αύξηση ήταν παρόμοια και στις δύο συνθήκες ( Εικ 2 D), υποδεικνύοντας και πάλι ότι η ενεργοποίηση του MERTK συνδέεται με την άγνοια αλλά δεν αντικατοπτρίζει τη σοβαρότητα και / ή τη διάρκεια της απώλειας ύπνου.

http://www.jneurosci.org/content/jneuro/37/21/5263/F2.medium.gif

Λήψη αριθμού  |  Ανοίξτε σε νέα καρτέλα  |  Κάντε λήψη του powerpoint

Σχήμα 2.

Η απώλεια ύπνου σχετίζεται με την ρύθμιση προς τα πάνω της MERTK. Ένα διάγραμμα θερμικής απεικόνισης που δείχνει τα επίπεδα έκφρασης των αστροκυτταρικών γονιδίων που προσδιορίστηκαν προηγουμένως ( Cahoy et al., 2008 ) ως ενδεικτικό της φαγοκυττάρωσης σε εμπλουτισμένα σε αστροκύτταρα δείγματα των S, W και SD ενηλίκων ετεροζυγωτικών ποντικών Aldh1L1-eGFP-L10a ( Bellesi et αϊ. , 2015 ). ^# ρ <0,05 σε S έναντι W, * p <0,1 και ** p <0,01 σε S έναντι SD. Β , Παράδειγμα αστροκυττάρου χρώματος με GFAP (κόκκινο) και συνεκφράζοντας MERTK (πράσινο) κατά μήκος των διαδικασιών του (βέλη βέλους). Γραμμή κλίμακας, 30 μm. ντο, Κορυφή, έκφραση GFAP σε ομογενοποιήματα φλοιού (HN) και σε συναπτορηρουροσώματα (SYN). Κάτω, αντιπροσωπευτικές ζώνες από ομάδες S, SD και CSR ( n = 4 ανά δεξαμενή) που δείχνουν έκφραση MERTK σε φλοιώδη συναπτωνευροσώματα. D , ποσοτικοποίηση Western blot της έκφρασης MERTK σε SD ( ρ <0.05) και CSR ( ρ <0.05) σε σχέση με S. Ε , Lipid ανάλυση υπεροξείδωση που δείχνει συγκέντρωση ΜϋΑ για ποντικούς S, SD, και CSR (δοκιμή KW, ρ = 0.065) .

Μέσω της δράσης του Gas6, ο υποδοχέας MERTK μπορεί να αναγνωρίσει τα σήματα "eat-me" στη μεμβράνη του κυττάρου που πρέπει να είναι φαγοκυττάρων. Αυτά τα σήματα περιλαμβάνουν την έκθεση της φωσφατιδυλσερίνης στο εξωτερικό φύλλο της μεμβράνης του πλάσματος ( Ravichandran, 2010 ), που μπορεί να συμβεί λόγω οξειδωτικού στρες ( Kagan et al., 2002 , Brown and Neher, 2014 ). Για να εκτιμηθεί εάν η απώλεια ύπνου συνδέθηκε με υψηλά επίπεδα οξειδωτικού στρες στο συναπτικό επίπεδο, μετρήσαμε την έκταση της υπεροξείδωσης λιπιδίων με την ποσοτικοποίηση του ελεύθερου MDA, ενός τελικού προϊόντος λιπιδικής υπεροξείδωσης, στα φλοιώδη συναπτωνευρώματα των S, SD και CSR ποντικών. Η χρωματομετρική ποσοτικοποίηση των επιπέδων MDA έδειξε παρόμοια τάση προς την αύξηση των SD και CSR ποντικών σε σχέση με τους ποντικούς S (δοκιμασία KW, p= 0,065), ενώ δεν παρατηρήθηκε διαφορά μεταξύ SD και CSR (δοκιμασία MW, ρ = 0,4, Εικόνα 2 Ε ).

Ο χρόνιος περιορισμός του ύπνου συνδέεται με την ενεργοποίηση της μικρογλοίας

Η πρωτεΐνη MERTK εκφράζεται επίσης σε μικρογλοία ( Chung et al., 2013 ) και η μικρογλοία συμβάλλει στη συναπτική εξάλειψη κατά τη φυσιολογική ανάπτυξη ( Paolicelli et al., 2011 , Schafer et al., 2012 , Bialas και Stevens, 2013 ) ( Sipe et αϊ., 2016 ). Έτσι, επιδιώξαμε να αξιολογήσουμε εάν η απώλεια ύπνου οδηγεί σε ενεργοποίηση μικρογλοίας στον εγκεφαλικό φλοιό ποντικού. Εμείς χρωματίστηκαν τομές εγκεφάλου S, SD, και ΕΚΕ με ΙΒΑ-1, ένα αναγνωρισμένο δείκτη για μικρονευρογλοία και ποσοτικοποιούνται πυκνότητα μικρογλοία στο μετωπιαίο φλοιό ( Σχ. 3 Α ). Παρά την μικρή αύξηση της CSR σε σχέση με τα ποντίκια SD και S, δεν διαπιστώσαμε σημαντικές αλλαγές στον αριθμό των κυττάρων (δοκιμή KW, σ= 0,09; Σχ. 3 Β ). Στη συνέχεια, αναλύσαμε τη μορφολογία των μικρογλοιακών κυττάρων, καθώς συσχετίζεται στενά με την κατάσταση ενεργοποίησής τους ( Kreutzberg, 1996 , Nimmerjahn et al., 2005 ). Για να ποσοτικοποιήσουμε την πολυπλοκότητα της διακλάδωσης microglia, χρησιμοποιήσαμε δύο διαφορετικές επικυρωμένες προσεγγίσεις. Η πρώτη μέθοδος ( Morrison and Filosa, 2013 ) υπολογίζει τον αριθμό των τελικών σημείων διεργασίας ανά κύτταρο και το μήκος των διεργασιών μικρογλοίας ανά κύτταρο, με σκελετοποίηση των πεδίων με απόχρωση IBA-1 ( εικόνα 3C ). Ο αριθμός των τελικών σημείων ανά κύτταρο δεν μεταβλήθηκε σημαντικά σε όλες τις συνθήκες (δοκιμασία KW, p = 0,15), αν και παρατηρήθηκε τάση προς μείωση στην CSR σε σχέση με τα ζώα S (δοκιμασία MW,ρ = 0,06; Εικ. 3 D ). Οι εξατομικευμένες συγκρίσεις μεταξύ ομάδων (S vs SD, SD vs CSR) δεν ήταν σημαντικές. Η ποσοτική ανάλυση έδειξε αντ 'αυτού μια σημαντική μείωση του μήκους διεργασίας ανά κύτταρο σε CSR σε σχέση με ποντικούς S (δοκιμασία MW, ρ = 0.004, Σχήμα 3 Ε ). Στη δεύτερη προσέγγιση, με τη χρήση ενός εξατομικευμένου αλγορίθμου Matlab βασισμένου στη μελέτη των Kozlowski και Weimer (2012) , μετρήσαμε την περιοχή και την περίμετρο αυτόματα, ξεχωριστά ταυτοποιημένων IBG-1 μικρογλοιακών κυττάρων. Για κάθε πειραματική ομάδα, τα κύτταρα συγκεντρώθηκαν σε τεταρτημόρια (από μικρή περιοχή / περίμετρο έως μεγάλη περιοχή / περίμετρο) και υπολογίστηκε ο σχετικός αριθμός κυττάρων εντός κάθε τεταρτημορίου ( Σχήμα 3F). Επαναλαμβανόμενες μετρήσεις αμφίδρομης ANOVA με πειραματική ομάδα ως παράγοντα μεταξύ των τεταρτημορίων, καθώς ο εσωτερικός παράγοντας έδειξε μια κύρια επίδραση της πειραματικής ομάδας (περιοχή: F _(2,14) = 4,16, p = 0,038, περίμετρος: F _{(2,14 )} = 3.74, ρ = 0.05) και μία σημαντική αλληλεπίδραση (περιοχή: F _(6,42) = 6.82, ρ <0.001? περίμετρο: F _(6,42) = 6.35, ρ <0.001). Η μετα-hoc ανάλυση διαπίστωσε ότι στο πρώτο τεταρτημόριο, ο αριθμός των κυττάρων ήταν υψηλότερος σε ποντίκια CSR σε σχέση με το S (περιοχή: δοκιμασία Bonferroni, t = 4.78, p<0,001; περιφέρεια: δοκιμή Bonferroni, t = 4.95; p<0,001) και SD (περιοχή: δοκιμασία Bonferroni, t = 4,58 · ρ <0,001 · περιφέρεια: δοκιμασία Bonferroni, t = 4,68 · p <0,001) : δοκιμή Bonferroni, το t = 3,44, ρ <0.01? περίμετρο: τεστ Bonferroni, το t = 3,44, ρ <0.01? ΕΚΕ vs SD, περιοχή: δοκιμή Bonferroni, το t = 4,06, ρ <0,001? περίμετρο: τεστ Bonferroni, το t = 3,44 , σ<0,01). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι υπήρχε ένας μεγαλύτερος αριθμός μικρότερων διακλαδισμένων κυττάρων και μικρότερος αριθμός καλά διακλαδισμένων κυττάρων σε ποντίκια CSR σε σχέση με τους ποντικούς SD και S ( Σχήμα 3 G , οι τιμές για την περίμετρο δεν φαίνονται).

http://www.jneurosci.org/content/jneuro/37/21/5263/F3.medium.gif

Λήψη αριθμού  | Ανοίξτε σε νέα καρτέλα  | Κάντε λήψη του powerpoint 

Σχήμα 3.

Η χρόνια απώλεια ύπνου σχετίζεται με την ενεργοποίηση της μικρογλοίας. A , πρώιμες εικόνες από ποντικούς S ( n = 6), SD ( n = 5) και CSR ( n = 6) (μετωπικός φλοιός) που εμφανίζουν χρώση IBA-1. Γραμμή κλίμακας, 30 μm. Β , Αριθμός κυττάρων θετικών κατά ΙΒΑ-1 ανά κυβικό χιλιοστόμετρο σε S, SD και CSR ποντίκια. C , Παράδειγμα ενός ΙΒΑ-1-θετικού μικρογλοιακού κυττάρου όπως φαίνεται από την πρώτη εικόνα και μετά την επεξεργασία (απεμπλοκή και σκελετοποίηση). D , E , Αριθμός τελικών σημείων ανά κύτταρο ( D ) και άθροισμα όλων των μηκών διεργασίας ανά μικρογλοιακό κύτταρο ( Ε ) σε S, SD και CSR ποντίκια. * ρ <0,05. φά, Αριστερά, Παραδείγματα από πεδία S και CSR που εμφανίζουν επεξεργασμένα και χρωματισμένα IBA-1 μικρογλοιακά κύτταρα (κίτρινα, πιο διακλαδισμένα, μπλε, λιγότερο διακλαδισμένα). Δεξιά, Παραδείγματα κυττάρων μικροκυττάρων IBA-1 κακώς διακλαδισμένων (πάνω) και πολύ διακλαδισμένων (κάτω). G , Κατανομή σε τεταρτημόρια του αριθμού μικρογαλακτικών κυττάρων ΙΒΑ-1 ταξινομημένων κατά μέγεθος περιοχής, έμμεση μέτρηση της πολυπλοκότητας της διακλάδωσης της διαδικασίας. * ρ<0,05.

Επιπλέον, ερευνήσαμε αν η απώλεια ύπνου προήγαγε μικρογλοιακή φαγοκυττάρωση με ποσοτικοποίηση του αριθμού και του όγκου των προσυναπτικών τερματικών, τα οποία αναγνωρίστηκαν ως VGLUT-1-θετικά σημεία με μικροσκοπική μικροσκόπηση, τα οποία υποβλήθηκαν σε απορρόφηση εντός IBA-1-χρωματισμένων κυττάρων. Μόνο VGLUT-1 θετικά σημεία μεγαλύτερα από 100 εικονοστοιχεία (περίπου αντιστοιχούν σε 0,03 μm ³ ) και παρουσιάζοντας επικάλυψη 100% σε xyz με μικρογλοιακά κύτταρα θεωρήθηκαν φαγοκυττάρια ( Σχήμα 4 Α-Γ ). Η ποσοτική ανάλυση έδειξε ότι ο αριθμός και ο όγκος των σημείων φαγοκυττάρων VGLUT-1 άλλαξε σημαντικά σε όλες τις συνθήκες (δοκιμασία KW, αριθμός, ρ = 0,03, όγκος, ρ= 0,03). Συγκεκριμένα, τα φαγοκύτταρα VGLUT-1 puncta ήταν πιο πολυάριθμα σε CSR ποντίκια από ποντίκια S (πυκνότητα, + 27,98 ± 13,56%, δοκιμασία MW, p = 0,009) και μεγαλύτερα σε ποντίκια CSR από ποντικούς S (+ 32,13 ± 22,38% ρ = 0,026) και SD ποντίκια (+38,52 ± 23,46%, δοκιμή ΜΒ, ρ = 0,03, Σχήμα 4 D , Ε ). Το ποσοστό των σημείων VGLUT-1 που απορροφήθηκαν εντός μικρογλοιών σε σχέση με τον συνολικό αριθμό VGLUT-1 puncta ήταν υψηλότερο σε CSR ποντικούς (0,39 ± 0,14%) από το S (0,22 ± 0,07%, δοκιμασία MW, p = 0,04) και SD ± 0,06%, δοκιμή ΜΒ, ρ = 0,017, δεδομένα που δεν δείχνονται) ποντίκια.

http://www.jneurosci.org/content/jneuro/37/21/5263/F4.medium.gif

Λήψη αριθμού  | Ανοίξτε σε νέα καρτέλα  | Κάντε λήψη του powerpoint

Σχήμα 4.

Η χρόνια απώλεια ύπνου σχετίζεται με τη φαγοκυττάρωση μικρογλοίας. Α , ακατέργαστη εικόνα που δείχνει μια IBA-1 θετική μικρογλοία (πράσινη) και βαφή VGLUT-1 puncta (ματζέντα) σε αντιπροσωπευτικό ποντίκι CSR. Γραμμή κλίμακας, 5 μm. Β , Διευρυμένο πλαίσιο της κυψέλης που απεικονίζεται στο Α , που απεικονίζεται επίσης στις προβολές xz και yz και σε γκρι διαχωρισμένα κανάλια, παρουσιάζοντας ένα θετικό στοιχείο VGLUT-1 που περιβάλλεται από το μικρογλοιακό soma (βέλη βέλους). C , 3D ανασυγκρότηση της ίδιας κελιά που δείχνει το απορροφημένο στοιχείο VGLUT-1 (βέλος βέλους). D , E , Αριθμός ( D ) και όγκος ( E) φαγοκυττάρων VGLUT-1 στοιχεία ανά μικρογλοιακό κύτταρο για S ( η = 6), SD ( η = 5) και CSR ( η = 6). * ρ <0,05. F , ανάλυση στυπώματος Western του συστατικού συμπληρώματος C3 για ομάδες SD και CSR σε σχέση με τις ομάδες S. Αντιπροσωπευτικές ζώνες απεικονίζονται παραπάνω από ομοιογενοποιητικά φλοιού των δεξαμενών S, SD και CSR ( η = 4 ανά δεξαμενή). G , πρωτεϊνικά επίπεδα κυτοκινών και χημειοκινών στο CSF από S ( n = 11), SD ( n = 10) και CSR ( n= 8) ποντικοί. Τα επίπεδα πρωτεϊνών μετρήθηκαν σε μεμονωμένα δείγματα CSF χρησιμοποιώντας τεχνολογία πολλαπλών μαγνητικών σφαιριδίων για την ταυτόχρονη μέτρηση των 23 κυτοκινών / χημειοκινών. Εμφανίζεται η έκφραση των ανιχνευόμενων μορίων και οι σχετικές τιμές ρ που λαμβάνονται από τη δοκιμασία KW.

Για να χαρακτηρίσουμε περαιτέρω τη μεσολαβούμενη από μικρογλοία φαγοκυττάρωση, μετρήσαμε επίπεδα έκφρασης C3 σε ομογενοποιημένα φλοιώδη ποντίκια S, SD και CSR. Το C3, ένα κεντρικό συστατικό του καταρράκτη του συμπληρώματος, εναποτίθεται σε κυτταρικά συντρίμματα και μπορεί να ενεργοποιήσει απευθείας τους υποδοχείς C3 σε μικρογλοία, ενεργοποιώντας έτσι τη φαγοκυττάρωση. Η ανάλυση στυπώματος κατά Western έδειξε ότι η έκφραση C3 ήταν υψηλότερη σε ποντίκια CSR από ποντικούς S (πολλαπλή δοκιμή σύγκρισης Dunn, ρ = 0,04). Παρά την κάποια μεταβλητότητα, τα ποντίκια SD εμφάνισαν επίσης υψηλότερα επίπεδα C3 από τα ζώα S (πολλαπλή δοκιμή σύγκρισης Dunn, p = 0,04), υποδηλώνοντας ότι ακόμη μικρότερες περίοδοι απώλειας ύπνου μπορούν να προκαλέσουν ενεργοποίηση C3 ( Εικόνα 4F ). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η CSR σχετίζεται με την ενεργοποίηση μικρογλυκαιμίας και την αυξημένη φαγοκυττάρωση.

Τέλος, διαπιστώσαμε εάν η ενεργοποίηση της μικρογλοίας συσχετίστηκε με αυξημένα επίπεδα φλεγμονωδών μεσολαβητών στο CSF. Το CSF εξήχθη σε επιπρόσθετες ομάδες ποντικών S, SD και CSR. Multiplex ανάλυση άνοσο δοκιμασία έδειξε ότι 14 από τα 23 μόρια που αναλύθηκαν (δηλαδή, IL1a, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL10, IL12, IL-17Α, G-CSF, ΙΡΝγ, MIP1a, και RANTES) ήταν μη ανιχνεύσιμα σε όλα σχεδόν τα CSF δείγματα. Εννέα από τα υπόλοιπα μόρια (δηλ. IL1b, IL9, IL12, IL13, Eotaxin, KC, MCP1, MIP1b και TNFa) ανιχνεύθηκαν σε 34-100% των δειγμάτων. Επίπεδα IL1b, IL9, IL-12, IL13, εοταξίνη, KC, ΜΟΡ-1, και MIP1b δεν άλλαξε σημαντικά σε όλες τις ομάδες, ενώ τα επίπεδα του ΤΝΡα ήταν υψηλότερα σε S ποντίκια σε σχέση με SD (δοκιμή MW, ρ = 0,018) και CSR (δοκιμή MW , ρ = 0,047 · Σχήμα 4G). Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι η CSR σχετίζεται με την ενεργοποίηση μικρογλυκαιμίας και την αυξημένη φαγοκυττάρωση χωρίς σημαντική αύξηση των φλεγμονωδών μεσολαβητών στο ΚΠΣ.

---

Συζήτηση

Δείχνουμε ότι η στέρηση του στενού ύπνου και η χρόνια απώλεια ύπνου αυξάνουν τον αριθμό των φαγοκυτταρικών συμβάντων που προκαλούνται από τα αστροκύτταρα στο φλοιώδες νευροπλάσιο του ποντικιού, ενώ μόνο η απώλεια χρόνιου ύπνου μπορεί να προκαλέσει μικρογλοιακή φαγοκυττάρωση. Στα αστροκύτταρα, η φαγοκυττάρωση σχετίζεται με αυξημένη έκφραση MERTK και υπεροξείδωση λιπιδίων, ενώ η φαγοκυττάρωση μικρογλοίας σχετίζεται με αυξημένα επίπεδα του συστατικού C3 του συμπληρώματος χωρίς σαφή σημάδια φλεγμονών στο ΕΝΥ.

Μόνο μερικές συνάψεις επηρεάζονται από το AP: οι περιφερειακές αστροκυτταρικές διεργασίες στοχεύουν το 80% όλων των διεγερτικών συνάψεων, οι μεγαλύτερες και το <10% αυτών κατά μέσο όρο υποβάλλονται σε AP. Τα εφηβικά μας ποντίκια είχαν ήδη βιώσει την κρίσιμη περίοδο του πιο έντονου συναπτικού κλαδέματος, αλλά πιθανότατα συνέβαινε πιο λεπτή συναπτική βελτίωση ( Hoel et al., 2016 ). Η πρώιμη αναπτυξιακή φαγοκυττάρωση στοχεύει κυρίως σε προσυναπτικά στοιχεία των παροδικών, πιθανώς ασθενέστερων, συνθηκών αμφιβληστροειδούς ( Schafer et al., 2012 , Chung et al., 2013). Αντίθετα, η φαγοκυττάρωση ενισχυμένη με αφύπνιση στοχεύει κατά προτίμηση μεγαλύτερες και κατά συνέπεια ισχυρότερες συνάψεις και συχνά περιλαμβάνει στοιχεία αξονικών έξω από το προσυναπτικό τερματικό. Έτσι, η γασική φαγοκυττάρωση μπορεί να εξυπηρετήσει διαφορετικές λειτουργίες: εξάλειψη υπερβολικών συνάψεων κατά την πρώιμη ανάπτυξη και υποβάθμιση συστατικών ισχυρών, πιθανώς καθιερωμένων συνάψεων σε απόκριση εκτεταμένου αφύπνισης κατά την εφηβεία. Τα αστροκύτταρα θα μπορούσαν να προωθήσουν την καθαριότητα των φθαρμένων συναπτικών συστατικών, ιδίως των αξονικών στοιχείων, με την υποβάθμιση των τμημάτων των μεμβρανών τους, ίσως καταστραφεί από την υπερβολική λιπιδική υπεροξείδωση. Αξιοσημείωτο, διαπιστώσαμε ότι η παρουσία μιτοχονδρίων μέσα στα προσυναπτικά κουτάλια δεν αύξησε την πιθανότητα να υπάρξει φαγακύτιση μιας συνάψεως. Αρχικά, το αποτέλεσμα αυτό φαίνεται να αποκλείει μια άμεση σχέση μεταξύ του μεταβολισμού της οξειδωτικής ενέργειας και του AP. Ωστόσο,Chavan et αϊ., 2015 ; de Vivo et al., 2017 ) και είναι σπάνια σε κεφαλές σπονδυλική στήλη ( Sorra και Harris, 2000 ), οι οποίες χαρακτηρίζονται από έντονη μεταβολική δραστηριότητα ( Harris et al., 2012 ), υποδηλώνοντας ότι η παρουσία μιτοχονδρίων μπορεί να είναι ένας φτωχός δείκτης της συνολικής μεταβολικής δραστηριότητας μιας συνάψεως.

Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι η εκτεταμένη εγρήγορση ενισχύει το AP μέσω ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει τον υποδοχέα MERTK. Στην πραγματικότητα, αρκετές ώρες αυθόρμητης αφύπνισης είναι επαρκείς για να ρυθμίσουν εκ των προτέρων την έκφραση Merkt σεσχέση με τον ύπνο ( Bellesi et al., 2015 ), αλλά όχι να αυξήσουν τη συχνότητα εμφάνισης του AP (αυτή τη μελέτη). Έτσι, η ενεργοποίηση της οδού MERTK μπορεί να ξεκινήσει κατά τη διάρκεια της αυθόρμητης αφύπνισης, αλλά οι μακροχρόνιες διαρθρωτικές συνέπειές της γίνονται εμφανείς μόνο μετά από παρατεταμένη απώλεια ύπνου. Ο MERTK αναγνωρίζει τα σήματα "eat me" που παρουσιάζονται σε υπολείμματα στόχων ( Ravichandran, 2010). 

Ένας από αυτούς είναι η φωσφατιδυλοσερίνη, ένα φωσφολιπίδιο που περιορίζεται κανονικά στο εσωτερικό φύλλο της μεμβράνης του πλάσματος, το οποίο προκαλεί φαγοκυττάρωση όταν εκτίθεται στην κυτταρική επιφάνεια. Αυξημένες συγκεντρώσεις ασβεστίου, εξάντληση του ΑΤΡ και οξειδωτικό στρες είναι όλοι παράγοντες που συνδέονται με τη δραστηριότητα και τον μεταβολισμό των κυττάρων που μπορούν να προκαλέσουν μετατόπιση μεμβράνης φωσφατιδυλοσερίνης ( Brown and Neher, 2014 ). 

Δεδομένου ότι η συναπτική δραστηριότητα αντιπροσωπεύει το μεγαλύτερο μέρος του ενεργειακού προϋπολογισμού του εγκεφάλου ( Harris et al., 2012 ), η μεγαλύτερη μεταβολική δραστηριότητα και / ή η αυξημένη παραγωγή αποβλήτων που επάγεται από εκτεταμένο αφύπνιση ( Cirelli et al., 2006) θα μπορούσαν να ευνοήσουν την εξωτερίκευση της φωσφατιδυλοσερίνης στη μεμβράνη πλάσματος των βαριά χρησιμοποιούμενων συνάψεων. Ένας άλλος πιθανός μηχανισμός εμπλέκει το C1q, το οποίο εντοπίζεται στις θέσεις της συναπτικής εξάλειψης στο αναπτυσσόμενο δικτυοερυθροποιητικό σύστημα ( Stevens et al., 2007 ). Η έκφραση και των τριών υπομονάδων του συμπλόκου C1q ρυθμίζεται προς τα πάνω όταν τα γαγγλιακά κύτταρα του αμφιβληστροειδούς εκτίθενται σε αστροκύτταρα και μέσω της ενεργοποίησης του C3 η C1q μπορεί να προκαλέσει την απομάκρυνση της συνάψεως από τον κλασικό συμπληρωματικό καταρράκτη ( Stevens et al., 2007 ). Αξιοσημείωτα, το mRNA της υπομονάδας C1q ρυθμίζεται προς τα πάνω στον φλοιό των ενήλικων αρουραίων στον ύπνο σε σχέση με τον ύπνο ( Cirelli et al., 2004) και στην τρέχουσα μελέτη, τα επίπεδα του C3 αυξήθηκαν μετά από οξεία και χρόνια απώλεια ύπνου σε σχέση με τον ύπνο. Χρησιμοποιώντας το ίδιο σύνολο δεδομένων αυτής της μελέτης, πρόσφατα διαπιστώσαμε ότι η συνοπτική πυκνότητα στον μετωπιαίο φλοιό δεν μεταβάλλεται μεταξύ S και SD και οι περισσότερες σπονδυλικές στήλες μειώνονται στο μέγεθος κατά τη διάρκεια του ύπνου κατά τρόπο ανάλογο του μεγέθους τους ( de Vivo et al., 2017 ) . Βασικά, αυτή η downscaling είναι διάχυτη αλλά επιλεκτική, εξοικονομώντας τις μεγάλες συνάψεις ( de Vivo et al., 2017 ), όπου δείχνουμε ότι το AP είναι πιο κοινό. Έτσι, οι ισχυρότερες και πιο "δύσκαμπτες" συνάψεις, των οποίων η δύναμη δεν φαίνεται να αλλάζει μεταξύ ύπνου και αφύπνισης, μπορούν να χρησιμοποιήσουν το AP για να ανακυκλώσουν τα δομικά στοιχεία και να εξασφαλίσουν μια σωστή συναπτική λειτουργία, ίσως όχι μόνο ως απάντηση σε ζημιές αλλά για να την αποτρέψουν.

Εκτός από το ΑΡ, βρήκαμε επίσης ενδοσώματα που περικλείονται μέσα στα PAPs. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, τα ενδοσώματα εμπλέκονται στην ανακύκλωση της μεμβράνης, την εμπορία υποδοχέων, την εξωκύτωση και τη διάθεση κυτταρικών αποβλήτων ( Maxfield and McGraw, 2004). Στις PAPs, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ότι μερικά από τα ενδοσώματα, εκείνα που περιέχουν αδιαβροχοποιημένο υλικό που μοιάζει με προσυναπτικά κυστίδια, αντιπροσωπεύουν περαιτέρω βήματα της διαδικασίας φαγοκυττάρωσης. Από την άλλη πλευρά, η μείωση των κενών ενδοσωμάτων μετά από χρόνια απώλεια ύπνου μπορεί να υποδεικνύει ότι χρησιμοποιούνται κατά τη διάρκεια της διαδικασίας απορρόφησης και / ή για την ανακύκλωση βαρέως χρησιμοποιούμενων μερών κυτταροπλασματικής μεμβράνης. Ανεξάρτητα από τη λειτουργική σημασία της, η οποία εξακολουθεί να είναι ασαφής, το εύρημα αυτό ευθυγραμμίζεται με τα αποτελέσματα μιας πρόσφατης μελέτης που χαρακτήριζε υπερδομικές αλλαγές στο κυτταρικό σώμα των φλοιωδών πυραμιδικών νευρώνων και διαπίστωσε ότι κενά ενδοσώματα παρατηρήθηκαν συχνότερα σε S σε σχέση με CSR ποντικούς ( de Vivo et αϊ., 2016 ).

Μικρογλοιακά κύτταρα, οι κάτοικος έμφυτη κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος στον εγκέφαλο, είναι σε εγρήγορση φρουρούς του νευρικού συντρίμμια εκκαθάρισης σύστημα, ψάχνει για σημάδια διείσδυσης από μολυσματικούς παράγοντες, και μεσολαβεί στην φλεγμονώδη και επισκευή απόκριση σε διάφορες βλάβες του εγκεφάλου ( Nimmerjahn et al, 2005. ? Hanisch and Kettenmann, 2007 , Tay κ.ά., 2017 ). Το Microglia επεκτείνει τακτικά τις προεξοχές τους για να αγγίξει στιγμιαία και να αντιληφθεί τη λειτουργική κατάσταση των συνάψεων κατά τρόπο εξαρτώμενο από τη δραστηριότητα ( Wake et al., 2009 , Tremblay et al., 2010 ) και ο ρόλος τους στην αναπτυξιακή συναπτική κλαδεία αναγνωρίστηκε πρόσφατα ( Paolicelli et al., 2011 , Schafer et al., 2012 ,Bialas and Stevens, 2013 . Sipe et αϊ., 2016 ). Οι δύο μοριακοί μηχανισμοί που συζητήθηκαν παραπάνω ως πιθανοί μεσολαβητές της ενεργοποίησης της AP που σχετίζεται με την αφύπνιση θα μπορούσαν να ισχύουν και για τα μικρογλοία που εκφράζουν τόσο τους υποδοχείς MERTK όσο και τους υποδοχείς C3 ( Stevens et al., 2007 , Chung et al.) και θα μπορούσαν να ενεργοποιηθούν με κάποια μορφή βλάβης σε συναπτικές μεμβράνες που προκαλούνται από παρατεταμένη νευρωνική δραστηριότητα. Ωστόσο, οι άμεσες μορφολογικές ενδείξεις μικρογλωσσικής ενεργοποίησης με μετάβαση σε ενεργό κατάσταση αμειβοειδούς και σημάδια φαγοκυττάρωσης μικρογλοίας εντοπίστηκαν μόνο μετά από περιορισμό του περιορισμού του ύπνου, υποδηλώνοντας ότι απαιτείται σοβαρή και παρατεταμένη απώλεια ύπνου για την πλήρη δέσμευση της μικρογλοίας. Η μικρογλοία και η αστροκυτταρική ενεργοποίηση αναφέρθηκαν στον ιππόκαμπο αρουραίου μετά από 5 ημέρες ολικής στέρησης ύπνου ( Hsu et αϊ., 2003). Επιπλέον, οι ποντικοί που υποβλήθηκαν σε αγωγή με την αντιβιοτική μινοκυκλίνη, αναστολέας της μικρογλυκικής ενεργοποίησης, έδειξαν μειωμένη ανάκαμψη της δραστηριότητας βραδείας κύματος μετά από 3 ώρες στέρησης ύπνου, προτρέποντας τους συγγραφείς να υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση μικρογλυκάλων μπορεί να συνεισφέρει στη συσσώρευση της ανάγκης ύπνου κατά τη διάρκεια της εκτεταμένης εγρήγορσης ( Wisor κ.ά., 2011 ). Στην ίδια μελέτη, ωστόσο, η σύντομη στέρηση του ύπνου δεν αύξησε την έκφραση IL1β, IL6 και TNFa σε ομογενοποιημένα εγκεφάλου και μείωσε την έκφραση του CD11b, το οποίο είναι εμπλουτισμένο σε μικρογλοία ( Wisor et al., 2011 ). Διαπιστώσαμε ότι οι 6-8 ώρες στέρησης του ύπνου, οι οποίες προκαλούν με συνέπεια ανάκαμψη ύπνου με αυξημένη δραστηριότητα βραδείας κύματος ( Bellesi et al., 2015), δεν οδήγησε σε ενεργοποίηση μικρογλοίας. Επομένως, στις πειραματικές συνθήκες, η μικρογλία είναι απίθανο να διαδραματίσει κάποιο ρόλο στην ομοιόσταση του ύπνου.

Η ενεργοποίηση μικρογλυκάλων μετά από χρόνια απώλεια ύπνου πραγματοποιήθηκε χωρίς σημεία νευροφλεγμονής. Σε αμφότερα τα ζώα και τους ανθρώπους, η απώλεια ύπνου έχει συσχετιστεί με μια προ-φλεγμονώδη κατάσταση ( Mullington et al., 2010 , Hurtado-Alvarado et al., 2013 ) και ίσως η ανάλυση CSF δεν ήταν αρκετά ευαίσθητη για να ανιχνεύσει ήπια φλεγμονή. Εναλλακτικά, η φλεγμονή του CSF μπορεί να εμφανιστεί μόνο σε πλήρως εμφυσημένες παθολογικές καταστάσεις αλλά όχι σε απόκριση στην απώλεια ύπνου αφ 'εαυτού. Δεδομένου ότι τα μικρογλοία, όπως τα αστροκύτταρα, συμμετέχουν στην απομάκρυνση των συνάπτικων συντριμμάτων, η ενεργοποίησή τους κατά τη διάρκεια παρατεταμένης αφύπνισης μπορεί να αντιπροσωπεύει τη φυσιολογική απόκριση αυτών των κυττάρων σε φθαρμένες συνάψεις. Μια εναλλακτική εξήγηση, ωστόσο, προτείνεται από το εύρημα ότι ο ύπνος προάγει την κάθαρση του αμυλοειδούς-β από τον ενδιάμεσο χώρο (. Xie et αϊ, 2013 ) ενώ στέρηση ύπνου προάγει την απόθεση αμυλοειδών πλακών ( . Lim et al, 2014 ), το οποίο με τη σειρά του μπορεί να οδηγήσει σε ενεργοποίηση μικρογλοίας ( Xiang et al., 2006 ? Halle et αϊ, 2008. ? Jung et al., 2015 ). Η συνεχής ενεργοποίηση του μικρογλοίας, ακόμη και σε χαμηλό επίπεδο (μικροσυστοιχία μικρογλοίας), μπορεί να οδηγήσει σε υπερβολικές και επιζήμιες αντιδράσεις σε δευτερογενή προσβολή, προωθώντας περαιτέρω παθολογικές καταστάσεις ( Perry and Holmes, 2014 ). Έτσι, υποθέτουμε ότι με την πρόκληση μικρογλοίας, η χρόνια απώλεια ύπνου μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία του εγκεφάλου σε άλλες μορφές βλάβης, συμπεριλαμβανομένου του νευροεκφυλισμού ( Perry and Holmes, 2014 , Calcia κ.ά., 2016), αν και αυτή η ιδέα πρέπει να δοκιμαστεί άμεσα.

Ο μοριακός μας έλεγχος ταυτοποίησε μεταγραφές Mertk και crk , και οι δύο που ανήκουν στην οδό MERTK, ως τα μόνα αστροκυτταρικά γονίδια που συνδέονται με τη φαγοκυττάρωση και υπερεκφράζονται μετά τη στέρηση ύπνου σε σχέση με τον ύπνο ( Bellesi et al., 2015 ). Ωστόσο, η παρούσα μελέτη είναι συσχετιστική και δεν γνωρίζουμε εάν οι υποδοχείς MERTK και C3 είναι απαραίτητοι ή επαρκείς για τη φαγοκυττάρωση που προκαλείται από απώλεια ύπνου. Τα μελλοντικά πειράματα μπορεί να είναι ικανά να συνδέσουν αιροπολυτικά και μικρογλοιακά μοριακές μεταβολές με την απώλεια ύπνου, για παράδειγμα χρησιμοποιώντας ποντίκια Mertk - / - ( Chung et al., 2013 ) και CR3 - / - ( Schafer et al., 2012 ).

---

Υποσημειώσεις

·                     Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από τις επιχορηγήσεις NIH DP 1OD579 (GT), 1R01MH091326 (GT), 1R01MH099231 (GT, CC) και 1P01NS083514 (GT, CC). Ευχαριστούμε τους Benjamin Jones, τον Hirotaka Nagai, τον Midori Nagai, τον Sakiko Honjoh, τον Alex Rodriguez, τον Kayla Peelman, τον Douglas Haswell και τον Giovanna Spano για τη συμβολή τους με τα πειράματα περιορισμού του ύπνου και την Sophia Loschky, Andrea Schroeder και Samuel Koebe .

·                     Οι δημιουργοί ανακοίνωσαν μη ανταγωνιζόμενα οικονομικά συμφέροντα.

·                     Η αλληλογραφία θα πρέπει να απευθύνεται στη Chiara Cirelli, Τμήμα Ψυχιατρικής, Πανεπιστήμιο Wisconsin-Madison, 6001 Research Park Boulevard, Madison, WI 53719. ccirelli@wisc.edu

Πηγή: http://www.jneurosci.org/content/37/21/5263

---

Κάντε κλικ για Βιβλιογραφικές αναφορές